新型細胞核靶向非病毒基因載體的研究.pdf

1、隨著生物技術與分子生物學的發(fā)展,以及人類基因組計劃的完成,基因治療已經(jīng)成為遺傳病、傳染病、癌癥等重大疾病的一種新興治療方法。有效地基因治療需要高效的傳遞載體。非病毒基因載體具有無免疫源性、低毒、廉價的優(yōu)點,但是相比于病毒載體,其轉染效率低,限制了其臨床應用。非病毒載體的基因傳遞有三個主要屏障:細胞膜、內(nèi)吞體膜、細胞核。本課題將糖皮質激素(GC)與陽離子聚合物連接,合成新型GC-聚陽離子化合物,以糖皮質激素作為核定位信號(NLS),增加載

2、體的細胞核靶向作用,提高轉染效率。利用糖皮質激素的脂溶性,用GC-聚陽離子修飾脂質體,得到新型的聚陽離子脂質體。同時用特異性細胞配體修飾脂質體,使其具有細胞特異性靶向和細胞核靶向的雙重作用。課題首先選擇5種具有21-羥基的糖皮質激素,將21-羥基用甲磺?；〈?再用Traut’s試劑(2-iminothiolane)將其與低分子量聚乙烯亞胺(PEI1800)接枝,合成糖皮質激素-聚陽離子(GC-PEI),用1H-NMR和紅外光譜驗證GC

3、與PEI的結合。采用瓊脂糖凝膠電泳、動態(tài)光散射、透射電鏡研究了它們與pDNA結合后粒子(polyplex)的理化性質,MTT法檢測其細胞毒性,用pEGFP-N1和pGL-3質粒評價了其在HEK293和HepG2細胞系中的轉染效率。將新型材料用異硫氰酸熒光素標記,激光共聚焦顯微鏡觀察其細胞內(nèi)定位。結果表明,5種polyplex的理化性質差別不大,細胞毒性明顯低于PEI25k,轉染效率的高低順序為:倍他米松-PEI＞地塞米松-PEI＞甲基強

4、的松龍-PEI＞潑尼松龍-PEI＞氫化可的松-PEI,表明新型GC-PEI的轉基因活性與取代的GC活性為正比關系,GC的活性越高,與受體結合的能力越強,則轉染活性越高。選取活性更強的曲安奈德(TA),與PAMAM(G4)接枝合成PAMAM-TA以提高其轉染效率,降低毒性。為檢驗TA取代度的影響,合成高、低取代度的PAMAM聚合物(PAMAM-TA-H的PAMAM-TA-L).研究表明,它們的理化性質相似。MTT檢測表明其毒性顯著低于PA

5、MAM與PEI25K。細胞內(nèi)定位研究表明PAMAM定位于細胞質,而PAMAM-TA-H和PAMAM-TA-L均定位于細胞核。這表明將TA接枝PAMAM會促進其細胞核定位,從而提高轉染效率。TA取代度低至0.22不會影響其細胞核定位能力。此外,將TA與不同分子量的PEI連接(Mw600,1800,25k),對其理化性質、細胞毒性、轉染效率和細胞內(nèi)定位進行了研究。結果表明,所得三種PEI-TA的理化性質相似,毒性明顯低于PEI25k,轉染效

6、率大小順序為PEI1800-TA＞ PEI600-TA＞ PEI25K-TA。用TA抑制轉染試驗表明,TA會顯著抑制PEI1800-TA和PEI600-TA的轉染效率,對PEI25K-TA無影響,說明PEI1800-TA和PEI600-TA會進入細胞核而提高轉染效率,因此TA與受體結合后會抑制其轉染效率,PEI25K-TA不會進入細胞核,因此不受TA影響。激光共聚焦顯微鏡觀察的結果證實了這一點。動物實驗表明,小鼠肝門靜脈注射后,PEI1

7、800-TA和PEI25k/pEGFP在肝臟中有較強的轉基因表達,而PEI1800-TA顯著高于PEI25k,這與體外實驗結果一致,而在其它臟器中無表達。最后,本文將PEI1800-TA與脂質體結合,制備聚陽離子脂質體,再用帶有半乳糖苷基團的[(2-乳糖酰胺基)乙胺基]甲酸膽固醇酯(CHEDLA)修飾脂質體,制備成連續(xù)靶向基因載體(STL),使其具有細胞核靶向和細胞特異性靶向功能,期望能夠有效突破各種障礙,實現(xiàn)高效的基因傳遞。通過理化性

8、質研究,表明PEI-TA成功修飾了脂質體,STL為納米結構,表面帶正電荷,能夠有效壓縮pDNA。STL的細胞毒性低于PEI-TA,而轉染效率高于后者。STL的組成中磷脂與PEI-TA的摩爾比為6:4,含有10％ CHEDLA時,轉染效率最優(yōu)。加入游離的半乳糖能夠顯著抑制STL的轉染,證明其肝細胞特異靶向性。體內(nèi)研究表明,肝門靜脈注射后,10% CHEDLA STL的肝臟表達顯著高于0%CHEDLA STL、PEI1800-TA和PEI2