豬靶向PRRS病毒shRNA轉(zhuǎn)基因克隆胚胎的體外生產(chǎn)與重編程發(fā)育.pdf

1、RNA干擾（RNAinterference，RNAi）是一種強(qiáng)大的基因沉默技術(shù)，它的發(fā)現(xiàn)為了解病毒與宿主之間的相互作用提供了又一新視角，在抗病毒領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。豬繁殖與呼吸綜合征（俗稱藍(lán)耳病，PRRS）是危害豬業(yè)生產(chǎn)的重大疫病之一，在全世界受到高度關(guān)注。研究表明，PRRS病毒（PRRSV）復(fù)制過程中也存在RNAi現(xiàn)象，并成功構(gòu)建特異性靶向PRRSV基因組的高效表達(dá)shRNA質(zhì)粒和病毒載體，為豬繁殖與呼吸綜合征防治提供了新的探索方

2、向。哺乳動(dòng)物胚胎生物技術(shù)的日益發(fā)展及其與現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的結(jié)合，使得利用遺傳修飾開展轉(zhuǎn)基因抗病育種成為可能。轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)是以轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞為核供體，通過核移植生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因胚胎或動(dòng)物的一種先進(jìn)技術(shù)手段。將RNAi和轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)相結(jié)合制備轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，已被用作人類疾病的動(dòng)物模型及動(dòng)物抗病育種研究;但迄今尚未見到具有抗豬藍(lán)耳病特性的相關(guān)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生產(chǎn)的報(bào)道。轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)本身依然存在效率低、外源基因表達(dá)不穩(wěn)定等問題。已有的研究表明，體細(xì)胞重編

3、程過程中，DNA甲基化、組蛋白乙?；瘜?duì)克隆效率和轉(zhuǎn)基因表達(dá)都有直接的影響。本研究將具有抗PRRSV特性的shRNA表達(dá)盒在轉(zhuǎn)基因載體進(jìn)行重組與表達(dá)，在制備出適用于體細(xì)胞克隆的轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒的基礎(chǔ)上，應(yīng)用克隆技術(shù)生產(chǎn)豬轉(zhuǎn)shRNA基因克隆胚胎。通過對(duì)轉(zhuǎn)基因克隆胚胎發(fā)育的研究，側(cè)重了解曲古抑菌素A(TSA)對(duì)轉(zhuǎn)基因克隆胚胎發(fā)育和相關(guān)基因表達(dá)的影響，研究其影響體細(xì)胞重編程發(fā)育的表觀遺傳機(jī)制;本研究所獲技術(shù)方案可取得較高的轉(zhuǎn)基因克隆囊胚發(fā)育率，為進(jìn)

4、一步的抗豬藍(lán)耳病轉(zhuǎn)基因育種奠定了基礎(chǔ)。本研究共包括以下4個(gè)部分:
　　試驗(yàn)1靶向PRRSV的shRNA轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體構(gòu)建及其功能驗(yàn)證
　　本試驗(yàn)旨在構(gòu)建靶向PRRSV的shRNA轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體，并通過轉(zhuǎn)染Marc145細(xì)胞，驗(yàn)證其抑制PRRSV復(fù)制的功能，為生產(chǎn)抗PRRSV克隆胚胎奠定基礎(chǔ)。根據(jù)已知靶向PRRSV的pSUPER-shRNA質(zhì)粒和pEGFP-N1質(zhì)粒的圖譜，在pSUPER-shRNA載體的shRNA表達(dá)盒上游引

5、入EcoO109I酶切位點(diǎn)，再將shRNA表達(dá)盒用限制性內(nèi)切酶EcoO109I切下，連接到載體pEGFP-N1對(duì)應(yīng)的酶切位點(diǎn)，經(jīng)酶切和PCR鑒定載體的正確性，結(jié)果表明成功構(gòu)建靶向PRRSV的shRNA轉(zhuǎn)基因表達(dá)載體pEGFP-G1;用pEGFP-G1轉(zhuǎn)染Marc145細(xì)胞24h后感染歐洲型PRRSV，病毒感染后每天觀察細(xì)胞病變(CPE)情況，結(jié)果表明所獲pEGFP-G1可明顯抑制PRRSV復(fù)制。
　　試驗(yàn)2核供體細(xì)胞對(duì)豬轉(zhuǎn)基因克隆

6、胚胎體外生產(chǎn)的影響
　　本試驗(yàn)旨在研究比較不同的核供體細(xì)胞，如豬胎兒成纖維細(xì)胞(PFF)、豬耳成纖維細(xì)胞(PEF)、豬PK-15細(xì)胞，在體外傳代培養(yǎng)過程中獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shRNA的細(xì)胞克隆作為供核細(xì)胞對(duì)克隆胚胎發(fā)育的影響，篩選出體外生產(chǎn)轉(zhuǎn)shRNA基因克隆胚胎的最佳核供體。對(duì)原代豬胎兒成纖維細(xì)胞分別采用組織塊與膠原酶消化2種方法分離培養(yǎng)，結(jié)果表明，采用組織塊法分離培養(yǎng)的PFF，形成細(xì)胞單層的時(shí)間為5～7d，而采用膠原酶消化法3d就可

7、以獲得細(xì)胞單層;組織塊培養(yǎng)豬耳成纖維細(xì)胞需要5～7d才始大量生長，形成單層需要9～10d。用pEGFP-G1分別轉(zhuǎn)染PFF、PEF和PK-15，經(jīng)600μg/mLG418篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shRNA的細(xì)胞克隆并擴(kuò)大培養(yǎng);再以穩(wěn)定轉(zhuǎn)染shRNA的PFF、PEF和PK-15細(xì)胞進(jìn)行核移植，比較其對(duì)豬克隆胚胎生產(chǎn)效率的影響，結(jié)果表明以轉(zhuǎn)染shRNA的PFF為核供體所構(gòu)建的克隆胚胎，囊胚發(fā)育率要顯著高于其他2組（26.6％對(duì)12.9％和0％;P＜

8、0.05）。本試驗(yàn)表明，以體外長期傳代培養(yǎng)的PK-15作為核供體細(xì)胞并未獲得囊胚發(fā)育，而分離培養(yǎng)的PFF、PEF作為供核細(xì)胞使用均可獲得囊胚發(fā)育，其中以PFF為供核細(xì)胞時(shí)，可獲得最佳的轉(zhuǎn)基因克隆囊胚發(fā)育率。
　　試驗(yàn)3豬轉(zhuǎn)基因克隆胚胎體外發(fā)育的研究
　　本試驗(yàn)旨在研究不同培養(yǎng)液、激活方法及曲古抑菌素A(TSA)對(duì)豬轉(zhuǎn)基因克隆胚胎體外發(fā)育的影響。用NCSU-23和PZM-3兩種培養(yǎng)基分別對(duì)豬孤雌激活胚胎進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果表明兩組的

9、卵裂率雖然無顯著差異（72.1％對(duì)75.0％，P＞0.05），但囊胚發(fā)育率差異顯著（20.9％對(duì)33.3％），表明PZM-3具有更佳的胚胎發(fā)育效果。比較電激活和電激活加6-DMAP兩種激活方式證明，兩組囊胚發(fā)育率差異不顯著。用50nMTSA分別處理供核細(xì)胞（A組）和核移植重構(gòu)胚（B組），或同時(shí)處理供核細(xì)胞和重構(gòu)胚（C組），并設(shè)不作TSA處理的對(duì)照組（D組），結(jié)果表明用TSA處理重構(gòu)胚(B、C組)要比單純處理供核細(xì)胞（A組）和對(duì)照組可獲得

10、更高的轉(zhuǎn)基因克隆囊胚發(fā)育率（分別為33.0％和35.7％對(duì)15.8％和20.0％;P＜0.05），僅用TSA處理供核細(xì)胞并不能提高囊胚發(fā)育率。
　　試驗(yàn)4曲古抑菌素A影響豬轉(zhuǎn)基因克隆胚胎發(fā)育的機(jī)理研究
　　為了評(píng)估供核細(xì)胞和重構(gòu)胚的表觀遺傳修飾對(duì)轉(zhuǎn)基因克隆胚胎重編程發(fā)育的影響，探討轉(zhuǎn)基因克隆胚胎發(fā)育調(diào)控的機(jī)理，采用組蛋白去乙酰化酶抑制劑TSA分成4組處理:A組50nMTSA在核移植操作前處理供核細(xì)胞24h，B組50nMTSA

11、處理激活后重構(gòu)胚24h，C組供核細(xì)胞與重構(gòu)胚均用TSA處理，D組不作TSA處理設(shè)為對(duì)照組。對(duì)各組所獲轉(zhuǎn)基因克隆胚胎不同發(fā)育階段的組蛋白H3K9乙酰化水平(AcH3K9)、組蛋白去乙?；騂dac1mRNA表達(dá)水平、甲基化相關(guān)基因Dnmt1mRNA表達(dá)水平、多能性相關(guān)基因Oct4mRNA表達(dá)水平、抗凋亡基因Bcl-2mRNA表達(dá)水平及外源基因(EGFP)表達(dá)水平進(jìn)行比較，結(jié)果表明TSA處理供核細(xì)胞并未影響轉(zhuǎn)基因克隆胚胎的乙?；?，但處

12、理重構(gòu)胚可明顯提高2-細(xì)胞胚乙?；剑⑻岣吣遗甙l(fā)育率。用TSA處理重構(gòu)胚，可有效增加4-細(xì)胞胚胎和囊胚Oct4mRNA的表達(dá)，刺激Bcl-2mRNA的表達(dá)，并降低Dnmt1mRNA的表達(dá)。在外源基因的表達(dá)上，TSA處理供核細(xì)胞或重構(gòu)胚均可較對(duì)照組增加EGFP表達(dá)，TSA處理似乎具有阻止外源基因沉默的作用。本試驗(yàn)表明，TSA處理可能通過提高豬轉(zhuǎn)基因克隆胚胎組蛋白乙酰化和抗凋亡能力來促進(jìn)其體外發(fā)育。本試驗(yàn)是體外生產(chǎn)抗豬藍(lán)耳病轉(zhuǎn)基因克隆胚