靶向基因shRNA干擾家蠶及豬若干病毒的復制和增殖研究.pdf

1、RNA干擾(RNA interference，RNAi)是指在進化過程中高度保守的、由雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）誘發(fā)的、同源mRNA高效特異性降解的現(xiàn)象。由于使用RNAi技術可以特異性剔除或關閉特定基因的表達，所以該技術已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病的基因治療領域。
　　 1豬圓環(huán)病毒（Porcine circovirus2，PVC2）病毒是我國豬場疫病復雜的重要原因，可以說它對養(yǎng)豬產(chǎn)

2、業(yè)正常維持帶來了極大的困難，對我國養(yǎng)豬產(chǎn)業(yè)的影響目前受到了僅次于高致病性藍耳病的空前關注，且目前尚無有效疫苗與治療方法。本文根據(jù)PVC2型病毒-Rep、Cap和ORF3/ORF4基因的結構序列和shRNA序列設計原則，進行地毯式搜索并設計合成了139對針對PVC2型病毒-Rep蛋白基因、134對針對PVC2型病毒-Cap蛋白基因、18對針對PVC2型病毒-ORF3/ORF4基因的shRNA序列，共計291對PVC2型病毒靶向shRNA。

3、將設計合成的291對shRNAs連接到線性化的RNAi-ReadypSIREN-RetroQ-ZsGreen載體上，構建成RNA干擾載體。分別在轉(zhuǎn)染試劑介導下導入無PCV2污染的豬腎PK15細胞，24小時后進行熒光觀察，確定轉(zhuǎn)染效率。并在轉(zhuǎn)染24小時后對細胞接種PCV2病毒，接毒72小時后收集細胞，通過Real-Time PCR方法檢測細胞中病毒的相對表達量，從而分析所設計的shRNA對PCV2病毒的抑制作用。結果表明，針對Rep基因序

4、列設計的139對shRNAs中，pSIREN-REP-C，pSIREN-REP-4, pSIREN-REP-23', pSIREN-REP-30', pSIREN-REP-33',pSIREN-REP-67'，pSIREN-REP-75'，pSIREN-REP-80'共8個序列表現(xiàn)出對PVC2病毒復制與增殖的抑制作用;針對Cap基因序列所設計的134對shRNAs中，pSIREN-Cap-3，pSIREN-Cap-5，pSIREN-Ca

5、p-C11'，pSIREN-Cap-14，pSIREN-Cap-80共5個序列表現(xiàn)出對PVC2病毒復制增殖的抑制作用，而針對ORF3和ORF4所設計的18對shRNAs并沒有表現(xiàn)出較顯著的對PVC2病毒復制增殖的抑制作用。綜上所述，以上對PCV2具有顯著抗病毒能力的shRNA靶向基因序列可作為轉(zhuǎn)基因的候選shRNA序列。
　　 2豬繁殖與呼吸綜合癥（Porcine Reproductive and Respiratory Syn

6、drome，PRRS）俗稱豬藍耳病，是一種新的豬傳染病，能夠引起母豬的生殖障礙及仔豬的呼吸道癥狀，在世界各地危害很大。豬生殖和呼吸系統(tǒng)綜合癥病毒（PRRSV）由ORF5、ORF6分別編碼的GP5、M蛋白是PRRSV病毒的主要結構蛋白，它們在病毒的致病性、病毒復制、病毒裝配、病毒變異和保護性反應等方面具有重要意義。本文根據(jù)豬藍耳病病毒PRRSV-ORF5及PRRSV-ORF6的基因結構序列和shRNA序列設計原則，分別設計和合成了5對針對

7、PRRSV-ORF5，5對針對PRRSV-ORF6編碼蛋白基因序列的靶向shRNA。將設計合成的shRNA連接到線性化的RNAi-Ready pSIREN-RetroQ-ZsGreen載體上，構建成RNA干擾載體。將上述質(zhì)粒DNA，分別在轉(zhuǎn)染試劑介導下導入Marc-145細胞，24小時后進行熒光觀察，確定轉(zhuǎn)染效率。同時，轉(zhuǎn)染細胞接種PRRSV病毒，72小時后收集細胞，通過Real-Time PCR方法檢測病毒感染后的相對表達量，分析所設

8、計的shRNA對PRRSV病毒的抑制作用。結果表明，分別針對ORF5和ORF6設計的共10對shRNAs均表現(xiàn)出抑制PRRSV病毒增殖復制的作用，但不同shRNA的抑制效果存在差異(0.71％-67.52％)。其中以ORF6-6e的病毒相對表達量最低，細胞內(nèi)病毒表達量僅為0.71％，即抗病毒能力最強，因此該序列可作為轉(zhuǎn)基因的候選shRNA序列。
　　 采用piggyBac轉(zhuǎn)座子構建轉(zhuǎn)座載體，為了便于篩選，以RNAi-Readyp

9、SIREN-RetroQ-ZsGreen載體為模板進行PCR擴增，得到ZsGFP基因，連接到PXL-BACⅡ上形成重組載體PXL-BACⅡ-ZsGFP;再以pSilencer4.1-CMVneo載體為模板進行PCR擴增，得到Neomycinr基因，與PXL-BACⅡ-ZsGFP連接，形成重組載體PXL-BACⅡ-ZsGFP-Neo。為了后期能將這兩個篩選基因給剔除掉，又在ZsGFP基因和Neomycinr基因的兩端加入了 FRT位點，形

10、成最終的轉(zhuǎn)座載體PXL-BACⅡ-FRT-ZsGFP-Neo。最后將在上述活性篩選試驗中挑選的具有最佳抗病毒能力的 shRNA(ORF6-6e)構建到該轉(zhuǎn)座載體，命名為PXL-BACⅡ-FRT-ZsGFP-Neo-shRNA。該轉(zhuǎn)基因載體同時具有篩選基因和標記基因，便于進行轉(zhuǎn)基因細胞的建立。該細胞株可穩(wěn)定傳代，以細胞基因組和RNA反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA為模板，分別經(jīng)PCR和RT-PCR確認，表明轉(zhuǎn)基因細胞中外源基因shRNA轉(zhuǎn)錄框、標記基因

11、GFP和篩選基因Neo均可正常轉(zhuǎn)錄和表達。該細胞株相對于正常Marc-145細胞具有較顯著的抗病毒能力，病毒相對表達量僅為0.01％，表明病毒在該轉(zhuǎn)基因細胞內(nèi)無法復制增殖。該研究為抗PRRSV病毒轉(zhuǎn)基因豬品種的培育與鑒定建立了方法，奠定了基礎。
　　 3家蠶核型多角體病毒（Bombyx mori nucleopolyhedrovirus，BmNPV）所引起的血液型膿病，是家蠶病毒病的主要類型，是在我國乃至世界養(yǎng)蠶業(yè)危害較為嚴重的

12、一種病毒病。家蠶抗病能力除了作為宿主本身的家蠶抗性機理外，作為病原一方的復制增殖也同樣重要，正所謂“無菌不成病”。本文正是從BmNPV在家蠶體內(nèi)的復制繁殖的角度開展研究。以BmNPV病毒的結構序列和shRNA序列設計原則，分別針對病毒復制增殖所必需的極早期表達因子ie-1，晚期表達因子lef-1，lef-2和lef-3等靶基因設計合成32對shRNA，以BmN細胞基因組為模板，通過PCR方法擴增得到BmU6啟動子，構建重組載體PXL-B

13、ACⅡ-GFP-BmU6-shRNA。將上述質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)染家蠶BmN細胞后接種BmNPV病毒，72小時后收集細胞，采用Real-Time PCR方法檢測病毒感染細胞后的相對表達量，以分析不同shRNA的抑制病毒復制與增殖活性。結果表明:shRNAs均表現(xiàn)出對BmNPV的抗病毒能力，但效果大有不同。其中，靶基因序列長度為21bp的shRNA-ie1c表現(xiàn)出對BmNPV復制增殖具有極顯著的抑制作用，病毒相對表達量僅為5.5％，其次為Lef3

14、e-2。與此同時，本試驗還設計并比較了不同靶序列長度:19bp和21bp在抑制BmNPV病毒增殖復制時的作用和差別。結果表明，lef1b(85％)和lef1b-2(29％)，lef2d(91％)和lef2d-2(38％)的抗病毒能力效果差異顯著，靶序列長度為21bp的病毒相對表達量較19bp病毒相對表達量分別減少56％和53％，說明shRNA干擾靶序列長度為21bp的RNA干擾病毒復制增殖效果優(yōu)于19bp。
　　 經(jīng)shRNA活

15、性篩選32對特異干擾靶向shRNA，分別針對極早期表達因子ie-1和晚期表達因子lef3的ie1c和lef3e-2表現(xiàn)出良好的抑制BmNPV的作用，因此將ie1c和lef3e-2作為轉(zhuǎn)基因的候選shRNA序列，構建到含有篩選基因Neo的轉(zhuǎn)座重組載體上，并構建單聯(lián)和雙聯(lián)重組轉(zhuǎn)座子載體，分別命名為PXL-BACⅡ-GFP-BmU6-shRNA(ie1c)-Neo和PXL-BACⅡ-GFP-double(ie1c/lef3e2)-Neo。在細

16、胞水平進行轉(zhuǎn)基因研究，建立含抗BmNPV病毒shRNA的轉(zhuǎn)基因細胞，評價其抑制病毒增殖活性。結果表明單聯(lián)重組轉(zhuǎn)座載體構建的轉(zhuǎn)基因細胞相對于正常BmN細胞具有較顯著的抗病毒能力:病毒感染0-24h，對照組細胞與轉(zhuǎn)基因細胞內(nèi)的病毒相對表達量均較低，分別為7.15％和0.45％，盡管在病毒感染初期，病毒DNA剛開始復制，仍可見轉(zhuǎn)基因細胞已初步表現(xiàn)出抗病毒增殖的能力;24-48h，對照組細胞內(nèi)病毒表達量呈指數(shù)增長趨勢(56.23％)，增加了49

17、.08％，而轉(zhuǎn)基因細胞組病毒相對表達量仍能維持較低水平(7.04％);48-96h，對照組細胞與轉(zhuǎn)基因細胞組的病毒相對表達量處于穩(wěn)定期，對照組病毒表達量始終維持較高水平(56.23％-64.03％)，高于轉(zhuǎn)基因細胞組約47％-52％;病毒感染96h后，正常細胞組的病毒相對表達量又呈現(xiàn)增長趨勢，約90％細胞的核內(nèi)充滿多角體，細胞死亡率上升，同時，隨著病毒感染時間的延長，轉(zhuǎn)基因細胞組抑制病毒復制增殖效果略有下降，但轉(zhuǎn)基因細胞病毒相對表達量仍

18、低于對照組細胞約30％-50％。因此，在感染BmNPV后0-96h內(nèi)，轉(zhuǎn)基因細胞表現(xiàn)出較好的抑制病毒增殖與復制的能力。
　　 雙聯(lián)重組轉(zhuǎn)座載體中含有上述活性檢測選出的兩條效果最好的shRNAs(ie1c/lef3e2)，其轉(zhuǎn)基因細胞的病毒相對表達量為42.49％，雖然較正常BmN細胞內(nèi)病毒表達量低，但是其抗病毒效果顯著低于單聯(lián)轉(zhuǎn)座的轉(zhuǎn)基因細胞(7.04％)的抗病毒能力。通過PCR、RT-PCR等方法確定轉(zhuǎn)基因細胞中外源基因均能正