靶向腦心肌炎病毒1D和3AB基因shRNA重組體構(gòu)建與體內(nèi)外抑制病毒復(fù)制作用.pdf

1、腦心肌炎病毒（Encephalomyocarditis virus，EMCV）是一種重要的人畜共患病病原，可以感染昆蟲、爬行動物、嚙齒類動物和靈長類動物等。本病毒可引起仔豬的致命性心肌炎和母豬的繁殖障礙，對世界養(yǎng)豬業(yè)造成了較大經(jīng)濟損失。目前，我國豬群已經(jīng)存在該病毒感染，但其流行狀況尚不十分清楚，也無有效預(yù)防和治療方法。
　　 本研究從我國中東地區(qū)患病豬群分離獲得EMCV NJ08毒株，人工感染試驗證實我國存在該病，并完成該病毒全

2、基因序列分析，闡明我國EMCV流行毒株分子特征;同時，設(shè)計構(gòu)建了表達(dá)靶向EMCV不同基因shRNA表達(dá)質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)其在體外和體內(nèi)可以有效抑制EMCV復(fù)制及其機制，并利用腺病毒介導(dǎo)shRNA技術(shù)探討該病防治新策略，為該病防治提供了新手段。
　　 1.豬源腦心肌炎病毒的分離與鑒定
　　 本研究采集臨床發(fā)病仔豬心臟組織，勻漿處理后接種BHK-21細(xì)胞，盲傳3代出現(xiàn)細(xì)胞病變，分離獲得一株病毒，病毒傳代至第15～25代，病毒滴度穩(wěn)定

3、，TCID50為10-10.0～10-10.25/mL;采用腦心肌炎病毒(EMCV)單克隆抗體進行間接免疫熒光試驗，結(jié)果在感染細(xì)胞的胞漿中可見特異性熒光;EMCV VP1基因RT-PCR檢測為陽性，擴增產(chǎn)物基因序列與GenBank中的EMCV VP1基因同源性為85.7％～99.8％;純化病毒粒子負(fù)染電鏡觀察，大小約25～28nm，證明該分離病毒為EMCV，命名為EMCVN J08株。該分離株接種MARC-145、HEK-293A和ST

4、細(xì)胞系均出現(xiàn)明顯CPE，病毒于56℃作用15 min，感染滴度顯著降低。將NJ08株接種BALB/c小鼠，可引起小鼠出現(xiàn)明顯臨床癥狀和心肌變性與腦炎等病變，免疫組織化學(xué)試驗檢測結(jié)果證明，腦組織含有EMCV抗原;商品仔豬人工感染NJ08株后未出現(xiàn)明顯的臨床癥狀及病理變化，但血清中出現(xiàn)EMCV特異性中和抗體，證明該分離株對小鼠具有較強的致病作用，表明我國豬群存在EMCV感染。
　　 2.豬腦心肌炎病毒NJ08分離株基因組序列測定與分

5、析
　　 本研究根據(jù)EMCV基因序列，設(shè)計合成7對PCR引物，采用RT-PCR方法從EMCVNJ08分離株擴增獲得5個基因片段，大小為1002～1580 bp，同時，應(yīng)用RACE方法，從該病毒株擴增獲得其3'和5'基因末端兩個基因，擴增產(chǎn)物經(jīng)凝膠純化后分別克隆于pMD18-T載體，進行基因測序，利用片段之間的重疊堿基序列順序?qū)⑦@些片段序列進行拼接，獲得EMCV NJ08株全基因組cDNA序列，并將全基因組及其推導(dǎo)的氨基酸序列與G

6、enBank中登錄的國內(nèi)外參考病毒株進行同源性比較及系統(tǒng)進化分析。結(jié)果為:EMCV NJ08分離株基因組全長7724 bp;屬于Ⅰa亞群;與GXLC、GX0602、BJC3、HB1等國內(nèi)分離株以及BEL-2887A、CBNU、K3、K11、EMCV-R、PV21等國外分離株同源性達(dá)99％以上;EMCV流行株的非結(jié)構(gòu)蛋白中3D最為保守，2A變異最大，結(jié)構(gòu)蛋白中VP2最為保守，VP1變異最大，從而豐富了我國EMCV分子流行病學(xué)資料。

7、　　 3.腦心肌炎痔毒SYBR GreenⅠ實時PCR檢測方法的建立
　　 本研究分別針對EMCV NJ08株的1D和3AB基因設(shè)計合成了特異性的引物，通過反應(yīng)條件的優(yōu)化，利用SYBR GreenⅠ染料建立了快速定量檢測腦心肌炎病毒的實時PCR方法。通過檢測PCV2、PRRSV、CSFV、PRV和FMDV的基因檢測及融解曲線檢測分析，結(jié)果表明兩對引物實時PCR反應(yīng)的熔解曲線具有唯一的尖峰，證明其具有較好的特異性。采用EMCV

8、cDNA產(chǎn)物進行梯度稀釋后作為模板進行檢測，結(jié)果為:該方法對EMCV細(xì)胞培養(yǎng)物的檢測下限為0.01 TCID50，敏感性比普通RT-PCR高100倍，并具有較好重復(fù)性。分別采用該法和普通RT-PCR方法檢測10份EMCV人工感染的小鼠心肌、腦組織、5份EMCV人工感染仔豬血清樣品及3份健康小鼠心腦組織和2份健康仔豬血清樣品檢測，其符合率為100％。表明該方法具有較高特異性和敏感性，同時具有更快速、準(zhǔn)確、低污染等優(yōu)點，可用于定量檢測EMC

9、V和該病診斷。
　　 4.靶向EMCV1D爭3AB基因shRNA重組質(zhì)粒構(gòu)建及其體內(nèi)外抑制EMCV復(fù)制作用
　　 本研究根據(jù)EMCV NJ08株基因序列(GenBank HM641897)，采用計算機軟件設(shè)計針對1D和3AB基因的4個siRNA靶序列，按pSUPER載體要求，合成了4對互補的寡核苷酸，分別體外退火形成雙鏈，克隆至pSUPER載體，經(jīng)KpnⅠ/EcoRⅠ雙酶切鑒定和基因測序，證明構(gòu)建獲得4個shRNA（sh

10、ort hairpin RNA）重組質(zhì)粒（pSUPER-1D-1，pSUPER-1D-2，pSUPER-3AB-1和pSUPER-3AB-2）。將其分別轉(zhuǎn)染BHK-21細(xì)胞，觀察其抑制EMCV NJ08復(fù)制及其機制，并以pSUPER-mN3（shRNA序列長度相同）為對照質(zhì)粒，結(jié)果為:pSUPER-1D-1、pSUPER-3AB-1和pSUPER-3AB-2均能明顯減輕EMCV引起的細(xì)胞病變(CPE)。pSUPER-3AB-1和pSUP

11、ER-3AB-2轉(zhuǎn)染細(xì)胞中EMCV滴度降低100～1000倍，pSUPER-1D-2或pSUPER-1D-1組病毒滴度降低10～100倍，EMCV VP1蛋白和3AB mRNA轉(zhuǎn)錄水平均明顯降低（p＜0.05）。選取90只4周齡BALB/c小鼠，隨機分為6組，每組15只。第1～4組分別腦內(nèi)接種重組質(zhì)粒pSUPER-1D-1、pSUPER-3AB-1、pSUPER-3AB-2和pSUPER-mN3，第5組腦內(nèi)接種ddH2O作為陰性對照，第

12、6組為空白對照組。第1～5組接種后6h、12h和24h，分別每組隨機選擇5只小鼠，采用EMCV進行攻擊，觀察臨床癥狀和死亡鼠病變，并于攻毒后14 d，對存活小鼠全部剖殺，進行病理學(xué)觀察，并用實時PCR方法檢測小鼠腦組織中EMCV含量。結(jié)果為:與pSUPER-mN3組和攻毒對照組相比，pSUPER-VP1-1、pSUPER-3AB-1和pSUPER-3AB-2組小鼠臨床癥狀、腦和心臟組織病變程度明顯減輕，病死率明顯降低，表明靶向EMCV1

13、D和3AB基因的shRNA可以有效減低EMCV靶基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)和病毒復(fù)制，降低EMCV對小鼠致病作用。
　　 5.靶向EMCV1D和3AB基因shRNA的重組腺病毒的構(gòu)建與鑒定
　　 本研究以shRNA重組質(zhì)粒pSUPER-1D-1、pSUPER-1D-2、 pSUPER-3AB-1和pSUPER-3AB-2為模板，利用RT-PCR擴增獲得4個Pm-shRNA表達(dá)框，分別克隆至重組腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-CMV中

14、，然后與骨架質(zhì)粒pAdEasy-1在大腸桿菌BJ5183內(nèi)進行同源重組，再將重組質(zhì)粒經(jīng)轉(zhuǎn)染HEK-293A細(xì)胞，獲得表達(dá)針對EMCV1D或3AB基因的shRNA重組腺病毒，命名為rAd-1D-1、 rAd-1D-2、 rAd-3AB-1和rAd-3AB-2，將重組腺病毒接種HEK-293A細(xì)胞后，出現(xiàn)明顯CPE，呈變圓和脫落，同時在熒光顯微鏡下出現(xiàn)特異性熒光。提取HEK-293A細(xì)胞中的病毒DNA，利用PCR和基因序列分析，證明重組腺病

15、毒基因組內(nèi)PH1-shRNA表達(dá)框內(nèi)基因序列正確，證明構(gòu)建獲得靶向EMCV1D或3AB shRNA的重組腺病毒，為EMCV感染防治研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 6.腺病毒介導(dǎo)的靶向EMCV1D和3AB基因shRNA體內(nèi)外抑制EMCV復(fù)制作用
　　 本研究將4個靶向EMCV1D（rAd-1D-1和rAd-1D-2）扣3AB(rAd-3AB-1和rAd-3AB-2)shRNA重組腺病毒(rAd5)分別接種MARC-145細(xì)胞，并以

16、rAd-G1重組腺病毒為對照，觀察其對EMCV復(fù)制作用，結(jié)果為:與對照組相比，該4個rAd5可以明顯抑制EMCV靶基因mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平及病毒復(fù)制滴度，而且這種抗病毒抑制作用至少能持續(xù)72 h，并有劑量依賴性。rAd5接種已經(jīng)感染EMCV的MARC-145細(xì)胞，可以部分抑制EMCV復(fù)制。選取96只6周齡BALB/c小鼠，隨機分為6組，每組16只。第1～4組腹腔接種rAd-1D-2、rAd-3AB-1、rAd-3AB-2和rAd-

17、G1（陰性對照），其中8只小鼠接種劑量為107.0 efu/mouse，另8只小鼠接種劑量為108.0efu/mouse，12h后在每只小鼠腹腔注射200 TCID50的EMCV N J08株病毒液，第5組作為EMCV攻毒對照組，第6組只注射PBS作為正常對照組。攻毒后觀察臨床癥狀和病理變化，第21 d，對存活的小鼠全部剖殺，觀察病變，并用實時PCR方法檢測小鼠腦組織中EMCV含量。結(jié)果為:第1～5組小鼠均表現(xiàn)出不同程度臨床癥狀和肉眼病