豬腦心肌炎病毒TJ株2C基因的克隆表達(dá)及ELISA檢測(cè)方法的建立.pdf

1、豬腦心肌炎是由腦心肌炎病毒(encephalomyomyocarditis virus,EMCV)引起的以仔豬腦炎、心肌炎和心肌周圍炎為主要臨床癥狀及母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎、木乃伊胎等繁殖障礙為主要臨床癥狀的急性傳染病。該病是一種人畜共患病，不僅給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失，也危害了人類的健康。EMCV 2C基因參與病毒基因組的復(fù)制，其表達(dá)產(chǎn)物2C蛋白具有良好的免疫原性。本文對(duì)EMCV TJ分離株的2C基因進(jìn)行了克隆，構(gòu)建了表達(dá)載體，獲得

2、了原核表達(dá)的2C蛋白，建立了檢測(cè)EMCV抗體的ELISA檢測(cè)方法，為EMC的流行病學(xué)和分子診斷奠定了基礎(chǔ)。 首先，將EMCV TJ株接種BHK-21細(xì)胞，24h后可見細(xì)胞圓縮、崩解。利用EMCV3D基因的特異性引物對(duì)出現(xiàn)細(xì)胞病變的培養(yǎng)上清進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果得到286 bp的目的片段，與預(yù)期的EMCV 3D片段長度一致。 參考GenBank上EMCV的2C基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，用RT-PCR技術(shù)對(duì)EMCV T

3、J株進(jìn)行擴(kuò)增，得到含有2C基因的特異性DNA片段。將此DNA片段繼續(xù)用2C表達(dá)引物擴(kuò)增，得到完整的2C基因，EMCV TJ株2C基因全長978個(gè)bp。EMCV TJ株2C基因與其它參考毒株的同源性在80.8％～99.8％之間，其中與BJC3的同源性最高達(dá)99.8％，與HB1為99.7％，與Mengo-M同源性最低為80.8％。 其次，將預(yù)表達(dá)目的片段克隆入原核表達(dá)載體pGEX-6P-1中，在0.1mM IPTG誘導(dǎo)下pGEX-6

4、P-2C在大腸桿菌中以包涵體的形式表達(dá)，表達(dá)蛋白的大小為61.6ku。重組蛋白經(jīng)包涵體洗滌和SDS-PAGE電泳分離純化后，進(jìn)行PVDF膜鑒定，結(jié)果顯示，重組蛋白可以被豬EMCV陽性血清特異性識(shí)別。 最后，以純化的2C蛋白為抗原，初步建立了檢測(cè)EMCV抗體的間接ELISA方法。用建立的間接ELISA方法，并對(duì)天津7個(gè)縣區(qū)91個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)的327份商品豬豬血清進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果有86個(gè)豬場(chǎng)的260份血樣為EMCV抗體陽性，豬場(chǎng)EMC