慢病毒介導(dǎo)的shRNA靶向干擾mTOR基因NIH-3T3穩(wěn)定細(xì)胞株的建立和有效干擾靶點(diǎn)的篩選.pdf

1、目的：
　　建立穩(wěn)定抑制mTOR基因表達(dá)的小鼠成纖維細(xì)胞NIH/3T3細(xì)胞株，為探討AKT/mTOR信號(hào)通路在ARMD發(fā)生中的作用提供細(xì)胞模型，觀察mTOR基因沉默對(duì)相關(guān)蛋白的影響。
　　方法：
　　根據(jù)鼠源mTOR基因mRNA序列，設(shè)計(jì)并構(gòu)建3對(duì)shRNA干擾序列sh1:AGTACTGTAGCACCTTGGG; sh2: TCTTCTCTCTGTAGTCCCG; sh3:TGACAAGGAGATAGAACGG，分別與

2、質(zhì)粒GIPZ-GFP+Puro載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒（慢病毒載體質(zhì)粒）。將慢病毒載體質(zhì)粒與慢病毒包裝質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染NIH/3T3細(xì)胞以包裝慢病毒，收集病毒上清感染NIH/3T3靶細(xì)胞，熒光顯微鏡觀察評(píng)價(jià)感染效率。以嘌呤霉素預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出的嘌呤霉素濃度藥篩，擴(kuò)大培養(yǎng)后得到穩(wěn)定細(xì)胞株。Trizol法提取RNA后，反轉(zhuǎn)錄出cDNA，應(yīng)用Real-time PCR檢測(cè)NIH/3T3細(xì)胞中mTOR在基因的表達(dá);全蛋白提取法提取細(xì)胞蛋白并BCA法測(cè)定蛋白

3、濃度，應(yīng)用Western blot檢測(cè)NIH/3T3細(xì)胞中mTOR在蛋白水平的表達(dá)，篩選出干擾效果最佳的shRNA序列。
　　結(jié)果：
　　1、mTOR在小鼠成纖維細(xì)胞株NIH/3T3中的表達(dá)結(jié)果:PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)在184 bp的位置出現(xiàn)了較亮條帶，說明mTOR基因表達(dá)量充足;條帶產(chǎn)物單一，未見雜帶，說明引物特異性較好，無明顯非特異性產(chǎn)物。Western blot蛋白水平檢測(cè)結(jié)果顯示mTOR蛋白灰度較深，產(chǎn)物單一。基因及蛋白水平

4、檢測(cè)結(jié)果均表明mTOR在小鼠成纖維細(xì)胞株NIH/3T3中的有較好的表達(dá)。
　　2、熒光鏡檢評(píng)價(jià)慢病毒感染及嘌呤霉素藥物篩選結(jié)果:感染NIH/3T3細(xì)胞3天后，熒光顯微鏡下觀察感染效率，各組感染效率均達(dá)90％。加用嘌呤霉素篩選3-6天，待空白對(duì)照細(xì)胞均死亡，穩(wěn)定細(xì)胞株建立形成。
　　3、有效干擾片段的篩選結(jié)果:Real—time PCR校正結(jié)果，低MOI，sh1:0.687±0.131; sh2:0.682±0.079; sh

5、3:0.547±0.066;陰性對(duì)照:0.996±0.036;空白對(duì)照:1.00。高M(jìn)OI，sh1:0.529±0.073; sh2:0.435±0.090; sh3:0.284±0.028;陰性對(duì)照:0.808±0.120;空白對(duì)照:1.00。將空白對(duì)照作為參照，在低MOI組中，sh1、sh2和sh3的敲低效率分別為31.3％、31.8％和45.3％。在高M(jìn)OI組中，sh1、sh2和sh3的敲低效率分別為47.1％、56.5％和71.

6、6％。Western blot檢測(cè)各組NIH/3T3細(xì)胞mTOR基因的蛋白表達(dá)，sh1、sh2和sh3 mTOR基因的蛋白表達(dá)均有不同程度減低。
　　結(jié)論：
　　本實(shí)驗(yàn)針對(duì)小鼠mTOR基因mRNA序列，設(shè)計(jì)了三條干擾靶點(diǎn)，并設(shè)置了一條陰性對(duì)照，排除轉(zhuǎn)染序列本身對(duì)基因表達(dá)的干擾，成功構(gòu)建了mTOR shRNA慢病毒表達(dá)載體。通過對(duì)干擾序列抑制基因表達(dá)的初步分析，篩選出了最有效的干擾片段sh3。同時(shí)，載體系統(tǒng)帶有嘌呤霉素抗性基因

7、，慢病毒質(zhì)粒感染細(xì)胞后，用含有嘌呤霉素的培養(yǎng)基對(duì)感染細(xì)胞進(jìn)行篩選，獲得了穩(wěn)定感染慢病毒載體的陽(yáng)性克隆細(xì)胞株。本研究結(jié)果顯示，我們構(gòu)建的慢病毒RNA干擾載體對(duì)鼠NIH/3T3細(xì)胞具有較高的感染效率。RT-PCR和Westem blot檢測(cè)證實(shí)mTOR基因的mRNA和蛋白水平在感染攜帶干擾靶點(diǎn)的慢病毒后顯著降低，從而可以有效地沉默NIH/3T3細(xì)胞中的mTOR基因表達(dá)，這表明有效RNA干擾的靶點(diǎn)設(shè)計(jì)成功，為進(jìn)一步研究mTOR基因在ARMD小