載體法篩選人巨細(xì)胞病毒UL54基因小干擾RNA靶位體系的建立.pdf

1、人巨細(xì)胞病毒是免疫功能低下宿主的重要病原體,也是宮內(nèi)感染引起先天性畸形以及兒童多器官損傷的一個(gè)重要致病因子.當(dāng)前的抗病毒藥物不能完全清除人巨細(xì)胞病毒,長(zhǎng)期、反復(fù)用藥引發(fā)的藥物毒副作用及不能忽視的耐藥問(wèn)題促使人們尋求一種更安全更有效的治療方法.RNA干擾作為一種新型的基因阻斷技術(shù),因其高效性、強(qiáng)特異性、低毒性等優(yōu)點(diǎn),在抑制病毒的復(fù)制、表達(dá)等方面顯示出了其強(qiáng)大的應(yīng)用潛力.UL54基因編碼HCMV的DNA多聚酶,為病毒復(fù)制所必需,它可作為HC

2、MV感染基因治療的靶基因.siRNA在RNAi過(guò)程中起著關(guān)鍵作用,因其識(shí)別的mRNA靶序列可能存在復(fù)雜的二級(jí)結(jié)構(gòu)干擾siRNA的識(shí)別.因此,合理設(shè)計(jì)siRNA并篩選出理想的靶位是十分有必要的.在本研究中,我們利用pAVU<,6+27>質(zhì)粒,設(shè)計(jì)并構(gòu)建6個(gè)shRNA表達(dá)載體(psiUL54-1～6),與融合蛋白表達(dá)載體pUL54S1/2-EGFP共轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察融合蛋白的熒光表達(dá)情況,通過(guò)RT-PCR來(lái)分析UL54S

3、1、UL54S2 mRBA水平的變化并利用流式細(xì)胞儀評(píng)價(jià)siRNA對(duì)融合蛋白的抑制作用,最終建立人巨細(xì)胞病毒UL54基因小干擾RNA靶位篩選體系.本研究分二部分: 第一部分,融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒pUL54S1-EGFP、pUL54S2-EGFP腳的構(gòu)建及在AD293細(xì)胞中的表達(dá) 方法:擴(kuò)增人巨細(xì)胞病毒UL54基因967-1750及2308-3070位點(diǎn)的序列,分別命名為UL54Sl(784bp)及UL54S2(763bp).

4、UL54S1、UL54S2用Hind Ⅲ和EcoRI雙酶切后分別定向克隆入已行雙酶切的質(zhì)粒pEGRP-Nl中,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5Gt中,PCR法及雙酶切法篩選陽(yáng)性克隆,并進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證.構(gòu)建成功的融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒行脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞,轉(zhuǎn)染后24h、48h通過(guò)熒光顯微鏡觀察熒光蛋白的表達(dá)情況,運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)AD293細(xì)胞表達(dá)EGFP陽(yáng)性細(xì)胞率和平均熒光強(qiáng)度. 結(jié)果: 1.PCR法及Hind Ⅲ、EcoR

5、Ⅰ雙酶切法篩選陽(yáng)性克隆并進(jìn)行測(cè)序,結(jié)果與GenBank登錄的HCMV AD169株的UL54基因(gi:1487749)967-1750及2308.3070位點(diǎn)的DNA序列完全一致. 2.質(zhì)粒pEGFP-Nl,及融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒pUL54SI-EGFP、pUL54S2-EGFP轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞24h、48h后均可在熒光顯微鏡下觀察到增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的表達(dá),而空白對(duì)照組則無(wú)增強(qiáng)型綠色熒光蛋白的表達(dá). 3.流式細(xì)胞儀檢測(cè)

6、結(jié)果顯示48h pEGFP-N1組平均轉(zhuǎn)染率為38﹪,平均熒光強(qiáng)度為590;pUL54S1-EGFP組平均轉(zhuǎn)染率為47﹪,平均熒光強(qiáng)度為547;pUL54S2-EGFP組平均轉(zhuǎn)染率為56﹪,平均熒光強(qiáng)度為578. 結(jié)論: 成功構(gòu)建融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒pUL54Sl-EGFP、pUL54S2-EGFP,運(yùn)用熒光顯微鏡可檢測(cè)到增強(qiáng)型綠色熒光蛋白在AD293細(xì)胞中的表達(dá).利用流式細(xì)胞儀可測(cè)定每孔細(xì)胞表達(dá)EGFP的陽(yáng)性細(xì)胞率及平均熒

7、光強(qiáng)度,達(dá)到對(duì)UL54S1、UL54S2基因的定量分析,為后續(xù)成功篩選出有效的siRNA靶位提供了依據(jù). 第二部分,人巨細(xì)胞病毒UL54基因小干擾RNA靶位篩選體系的建立 方法:利用siRNA在線設(shè)計(jì)工具選取6個(gè)siRNA靶位點(diǎn),合成相應(yīng)的shDNA模板.利用合成的shDNA模板及pAVU<,6+27>質(zhì)粒,構(gòu)建6個(gè)shRNA表達(dá)載體,命名為psiUL54-1～6.shRNA表達(dá)載體與融合蛋白表達(dá)載體pUL54S1/2-

8、EGFP共轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察融合蛋白的熒光表達(dá)情況,通過(guò)RT-PCR分析UL54S1、UL54S2 mRNA水平的變化,并利用流式細(xì)胞儀評(píng)價(jià)siRNA對(duì)融合蛋白的抑制作用. 結(jié)果: 1.PCR法篩選shRNA表達(dá)載體陽(yáng)性克隆,經(jīng)測(cè)序,psiUL54-2～6序列與預(yù)期序列完全一致. 2.熒光顯微鏡下觀察質(zhì)粒psiUL54-4～6與pUL54S2-EGFP共轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞48h后細(xì)胞中熒光蛋白的

9、表達(dá)無(wú)明顯變化;質(zhì)粒psiUL54-2與pUL54SJ-E6FP共轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞48h后熒光蛋白的表達(dá)無(wú)明顯變化;質(zhì)粒psiUL54-3與pUL54S1-EGFP共轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞48h后可引起熒光蛋白的表達(dá)下降; 3. RT-PCR結(jié)果顯示質(zhì)粒psiUL54-4～6與pUL54S2-EGFP共轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞24h、48h后UL54S2 mRNA水平無(wú)明顯變化;質(zhì)粒psiUL54-2與pUL54S1-E6FP共轉(zhuǎn)染AD

10、293細(xì)胞24h、48h后UL54S1 mRNA水平無(wú)明顯變化:質(zhì)粒psiUL54-3.與pUL54S1-EGFP共轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞24h后UL54S1 mRNA水平無(wú)明顯變化,轉(zhuǎn)染48h后則可引起UL54S1 mRNA水平的下降. 4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒psiUL54-2與pUL54S1-EGFP共轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞48h對(duì)融合蛋白UL54S1-EGFP的表達(dá)無(wú)影響(P)0.05);質(zhì)粒psiUL54-3

11、與pUL54S1-EGFP共轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞48h對(duì)融合蛋白UL54S1-EGFP的表達(dá)有抑制作用(P<0.01);質(zhì)粒psiUL54-4～6與pUL54S2-EGFP共轉(zhuǎn)染AD293細(xì)胞48h后對(duì)融合蛋白UL54S2-EGFP的表達(dá)均無(wú)影響(P)0.05). 結(jié)論:質(zhì)粒psiUL54-3表達(dá)的siRNA能下調(diào)UL54S1基因mRNA水平,有效抑制融合蛋白UL54S1-EGFP的表達(dá);UL54因序列中1532-1550位點(diǎn)是有