載體法篩選人巨細胞病毒UL54基因小干擾RNA靶位體系的建立.pdf

1、人巨細胞病毒是免疫功能低下宿主的重要病原體,也是宮內(nèi)感染引起先天性畸形以及兒童多器官損傷的一個重要致病因子.當前的抗病毒藥物不能完全清除人巨細胞病毒,長期、反復用藥引發(fā)的藥物毒副作用及不能忽視的耐藥問題促使人們尋求一種更安全更有效的治療方法.RNA干擾作為一種新型的基因阻斷技術,因其高效性、強特異性、低毒性等優(yōu)點,在抑制病毒的復制、表達等方面顯示出了其強大的應用潛力.UL54基因編碼HCMV的DNA多聚酶,為病毒復制所必需,它可作為HC

2、MV感染基因治療的靶基因.siRNA在RNAi過程中起著關鍵作用,因其識別的mRNA靶序列可能存在復雜的二級結構干擾siRNA的識別.因此,合理設計siRNA并篩選出理想的靶位是十分有必要的.在本研究中,我們利用pAVU<,6+27>質(zhì)粒,設計并構建6個shRNA表達載體(psiUL54-1～6),與融合蛋白表達載體pUL54S1/2-EGFP共轉(zhuǎn)染AD293細胞,熒光顯微鏡下觀察融合蛋白的熒光表達情況,通過RT-PCR來分析UL54S

3、1、UL54S2 mRBA水平的變化并利用流式細胞儀評價siRNA對融合蛋白的抑制作用,最終建立人巨細胞病毒UL54基因小干擾RNA靶位篩選體系.本研究分二部分: 第一部分,融合蛋白表達質(zhì)粒pUL54S1-EGFP、pUL54S2-EGFP腳的構建及在AD293細胞中的表達 方法:擴增人巨細胞病毒UL54基因967-1750及2308-3070位點的序列,分別命名為UL54Sl(784bp)及UL54S2(763bp).

4、UL54S1、UL54S2用Hind Ⅲ和EcoRI雙酶切后分別定向克隆入已行雙酶切的質(zhì)粒pEGRP-Nl中,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞DH5Gt中,PCR法及雙酶切法篩選陽性克隆,并進行測序驗證.構建成功的融合蛋白表達質(zhì)粒行脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染AD293細胞,轉(zhuǎn)染后24h、48h通過熒光顯微鏡觀察熒光蛋白的表達情況,運用流式細胞儀檢測AD293細胞表達EGFP陽性細胞率和平均熒光強度. 結果: 1.PCR法及Hind Ⅲ、EcoR

5、Ⅰ雙酶切法篩選陽性克隆并進行測序,結果與GenBank登錄的HCMV AD169株的UL54基因(gi:1487749)967-1750及2308.3070位點的DNA序列完全一致. 2.質(zhì)粒pEGFP-Nl,及融合蛋白表達質(zhì)粒pUL54SI-EGFP、pUL54S2-EGFP轉(zhuǎn)染AD293細胞24h、48h后均可在熒光顯微鏡下觀察到增強型綠色熒光蛋白的表達,而空白對照組則無增強型綠色熒光蛋白的表達. 3.流式細胞儀檢測

6、結果顯示48h pEGFP-N1組平均轉(zhuǎn)染率為38﹪,平均熒光強度為590;pUL54S1-EGFP組平均轉(zhuǎn)染率為47﹪,平均熒光強度為547;pUL54S2-EGFP組平均轉(zhuǎn)染率為56﹪,平均熒光強度為578. 結論: 成功構建融合蛋白表達質(zhì)粒pUL54Sl-EGFP、pUL54S2-EGFP,運用熒光顯微鏡可檢測到增強型綠色熒光蛋白在AD293細胞中的表達.利用流式細胞儀可測定每孔細胞表達EGFP的陽性細胞率及平均熒

7、光強度,達到對UL54S1、UL54S2基因的定量分析,為后續(xù)成功篩選出有效的siRNA靶位提供了依據(jù). 第二部分,人巨細胞病毒UL54基因小干擾RNA靶位篩選體系的建立 方法:利用siRNA在線設計工具選取6個siRNA靶位點,合成相應的shDNA模板.利用合成的shDNA模板及pAVU<,6+27>質(zhì)粒,構建6個shRNA表達載體,命名為psiUL54-1～6.shRNA表達載體與融合蛋白表達載體pUL54S1/2-

8、EGFP共轉(zhuǎn)染AD293細胞,熒光顯微鏡下觀察融合蛋白的熒光表達情況,通過RT-PCR分析UL54S1、UL54S2 mRNA水平的變化,并利用流式細胞儀評價siRNA對融合蛋白的抑制作用. 結果: 1.PCR法篩選shRNA表達載體陽性克隆,經(jīng)測序,psiUL54-2～6序列與預期序列完全一致. 2.熒光顯微鏡下觀察質(zhì)粒psiUL54-4～6與pUL54S2-EGFP共轉(zhuǎn)染AD293細胞48h后細胞中熒光蛋白的

9、表達無明顯變化;質(zhì)粒psiUL54-2與pUL54SJ-E6FP共轉(zhuǎn)染AD293細胞48h后熒光蛋白的表達無明顯變化;質(zhì)粒psiUL54-3與pUL54S1-EGFP共轉(zhuǎn)染AD293細胞48h后可引起熒光蛋白的表達下降; 3. RT-PCR結果顯示質(zhì)粒psiUL54-4～6與pUL54S2-EGFP共轉(zhuǎn)染AD293細胞24h、48h后UL54S2 mRNA水平無明顯變化;質(zhì)粒psiUL54-2與pUL54S1-E6FP共轉(zhuǎn)染AD

10、293細胞24h、48h后UL54S1 mRNA水平無明顯變化:質(zhì)粒psiUL54-3.與pUL54S1-EGFP共轉(zhuǎn)染AD293細胞24h后UL54S1 mRNA水平無明顯變化,轉(zhuǎn)染48h后則可引起UL54S1 mRNA水平的下降. 4.流式細胞儀檢測結果進行統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)質(zhì)粒psiUL54-2與pUL54S1-EGFP共轉(zhuǎn)染AD293細胞48h對融合蛋白UL54S1-EGFP的表達無影響(P)0.05);質(zhì)粒psiUL54-3

11、與pUL54S1-EGFP共轉(zhuǎn)染AD293細胞48h對融合蛋白UL54S1-EGFP的表達有抑制作用(P<0.01);質(zhì)粒psiUL54-4～6與pUL54S2-EGFP共轉(zhuǎn)染AD293細胞48h后對融合蛋白UL54S2-EGFP的表達均無影響(P)0.05). 結論:質(zhì)粒psiUL54-3表達的siRNA能下調(diào)UL54S1基因mRNA水平,有效抑制融合蛋白UL54S1-EGFP的表達;UL54因序列中1532-1550位點是有