豬轉(zhuǎn)基因克隆胚胎體外生產(chǎn)的研究.pdf

1、動(dòng)物轉(zhuǎn)基因技術(shù)就是指利用分子生物學(xué)技術(shù)，在遺傳學(xué)的和DNA重組技術(shù)基礎(chǔ)上將分離得到的外源目的基因（重組）導(dǎo)入動(dòng)物受精卵或早期胚胎細(xì)胞中，使之整合到宿主細(xì)胞的基因組內(nèi)，穩(wěn)定地遺傳給下一代的一種生物技術(shù)手段。其目的是改造生物的遺傳物質(zhì)，獲得一些在性狀、營養(yǎng)和消費(fèi)品質(zhì)等方面具有優(yōu)良特性的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物已成為當(dāng)今生命科學(xué)一個(gè)發(fā)展最快、最熱門的領(lǐng)域。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)在建立動(dòng)物模型，研究基因功能，治療人類疾病，動(dòng)物抗病育種，異種器官移植和

2、生物制藥等許多方面都具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。其中在畜牧業(yè)中，轉(zhuǎn)基因技術(shù)為改造動(dòng)物品種開辟了新途徑，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)將某些促進(jìn)生長、抗病性強(qiáng)的基因?qū)朐瓉聿痪邆溥@些性能的細(xì)胞中，經(jīng)過轉(zhuǎn)基因克隆有助于培育動(dòng)物新品種。盡管轉(zhuǎn)基因動(dòng)物技術(shù)在以上所述的廣泛領(lǐng)域都具有重要的應(yīng)用潛力，但是轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的成功率和成活率依然偏低，轉(zhuǎn)入的外源基因整合率低、效果不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的安全性問題等等，嚴(yán)重制約了該技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展與應(yīng)用。豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porci

3、ne reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)是一種可引起成年母豬的繁殖障礙和仔豬的呼吸道疾病的嚴(yán)重傳染病，給我國豬業(yè)生產(chǎn)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究擬將RNA干擾(RNAi)基因沉默技術(shù)與體細(xì)胞核移植技術(shù)相結(jié)合，體外生產(chǎn)抗豬藍(lán)耳病shRNA轉(zhuǎn)基因克隆胚胎，側(cè)重優(yōu)化和完善豬體細(xì)胞轉(zhuǎn)基因克隆技術(shù)程序，分析采用該技術(shù)方法可能存在的一些問題;以期提高豬轉(zhuǎn)基因克隆胚胎的體外生產(chǎn)效率。試驗(yàn)

4、主要以豬體外成熟卵母細(xì)胞為材料，研究豬體細(xì)胞克隆胚胎體外生產(chǎn)的關(guān)鍵技術(shù)，建立較為完善的技術(shù)體系，并在此基礎(chǔ)上穩(wěn)定生產(chǎn)豬抗PRRSV轉(zhuǎn)基因克隆胚胎。試驗(yàn)結(jié)果如下:
　　1.激素處理對豬卵母細(xì)胞成熟的影響取屠宰場采集的豬卵巢，用抽吸法采集直徑2～5mm卵泡的卵丘-卵母細(xì)胞復(fù)合體(COCs)，所用基礎(chǔ)培養(yǎng)液為TCM-199并添加10％豬卵泡液(PFF)、5％胎牛血清(FBS)、10ng/mL表皮生長因子(EGF)和0.1mg/mLL-半

5、胱氨酸。對照組COCs培養(yǎng)液中額外添加10IU/mL孕馬血清促性腺激素(PMSG)和10IU/mL人絨毛膜促性腺激素(hCG)培養(yǎng)42h。試驗(yàn)組COCs頭20h的培養(yǎng)液同對照組，后移入無激素的TCM-199基礎(chǔ)液中培養(yǎng)22h。統(tǒng)計(jì)卵母細(xì)胞成熟率，對照組卵母細(xì)胞成熟培養(yǎng)后的第一極體(pbI)排出率為73.23％，而試驗(yàn)組pbI排出率為86.48％，兩組差異顯著(P＜0.05)。試驗(yàn)表明，采用先在添加10IU/mL PMSG和10IU/mL

6、 hCG激素的TCM-199基礎(chǔ)培養(yǎng)液中培養(yǎng)20h，再轉(zhuǎn)入無激素TCM-199基礎(chǔ)培養(yǎng)液中培養(yǎng)22h的成熟培養(yǎng)方案，可獲得較好的卵母細(xì)胞成熟率和胞質(zhì)質(zhì)量。
　　2.細(xì)胞周期同期化處理對豬轉(zhuǎn)基因克隆胚胎發(fā)育的影響以豬轉(zhuǎn)基因胎兒成纖維細(xì)胞作為供核細(xì)胞，試驗(yàn)組分別用血清饑餓法和接觸抑制法誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因供核細(xì)胞進(jìn)入G0/G1期，豬體外成熟卵母細(xì)胞為受體，進(jìn)行體細(xì)胞核移植試驗(yàn)。結(jié)果顯示細(xì)胞周期同期化處理對轉(zhuǎn)基因克隆胚胎的發(fā)育具有一定的影響，試驗(yàn)

7、組囊胚發(fā)育率分別為26.79％和21.78％，均高于對照組囊胚發(fā)育率(16.67％)，但三組間差異不顯著(P＞0.05)。
　　3.供核細(xì)胞保存方式對豬轉(zhuǎn)基因克隆胚胎發(fā)育的影響試驗(yàn)分3組（新鮮消化組、4℃冷藏組和-70℃冷凍組），比較不同保存方式對豬轉(zhuǎn)基因克隆胚胎發(fā)育的影響。結(jié)果表明，4℃冷藏組和新鮮消化組供核細(xì)胞所獲囊胚發(fā)育率均顯著高于-70℃冷凍組（分別為20.17％和20.56％對7.79％，P＜0.05），而4℃冷藏組和新

8、鮮消化組間的囊胚發(fā)育率無顯著差異(P＞0.05)。
　　4.激活方法對克隆胚胎發(fā)育的影響以豬胎兒成纖維細(xì)胞為核供體構(gòu)建克隆重構(gòu)胚，在理想?yún)?shù)1.5kV/cm、40μs和1DC下，分別研究了電激活以及電激活后6-DMAP化學(xué)激活處理重構(gòu)胚后對豬克隆胚發(fā)育的影響，結(jié)果顯示無論是單純使用電激活還是電激活加6-DMAP處理，兩組間卵裂率和囊胚發(fā)育率均無顯著差異(69.39％對70.53％,25.51％對22.11％,P＞0.05)。

9、>　　5.不同轉(zhuǎn)基因供核細(xì)胞對豬轉(zhuǎn)基因克隆胚胎早期發(fā)育的影響分別以豬胎兒成纖維細(xì)胞(pFF)和耳成纖維細(xì)胞(pEF)為核供體，分別進(jìn)行體細(xì)胞核移植，比較它們對克隆胚發(fā)育的影響，結(jié)果顯示雖然兩組的卵裂率無顯著差異(77.31％對80.00％，P＞0.05)，但pFF組的囊胚發(fā)育率(23.71％)要顯著高于pEF組(15.88％)。
　　6.TSA處理對豬轉(zhuǎn)基因克隆胚胎發(fā)育的影響0nM和50nM TSA處理核供體細(xì)胞，獲得囊胚發(fā)育率（