豬體細(xì)胞克隆胚胎著床前發(fā)育期間H3K27乙酰化重編程規(guī)律研究.pdf

1、體細(xì)胞克隆技術(shù)為創(chuàng)制抗病、產(chǎn)品品質(zhì)提升、節(jié)糧和環(huán)保等目標(biāo)性狀改良的轉(zhuǎn)基因豬育種新材料提供了可能,也有助于拓展以豬為模型,開(kāi)展人類(lèi)相關(guān)疾病研究,尤其是與轉(zhuǎn)基因、干細(xì)胞等生物技術(shù)結(jié)合,有望建立豬源生物反應(yīng)器以生產(chǎn)藥物蛋白、為人類(lèi)器官移植開(kāi)辟異源供體以及生物學(xué)機(jī)理研究等提供革命性的手段。目前克隆效率依然低下,其最根本原因是表觀(guān)重編程不徹底。表觀(guān)遺傳修飾主要包括DNA甲基化/去甲基化、組蛋白修飾(如乙?；?去乙?；?、甲基化/去甲基化、SUMO化

2、、磷酸化等)等。其中組蛋白是染色體上核小體的核心,其物理學(xué)和化學(xué)修飾的變化都會(huì)影響相應(yīng)區(qū)域的基因表達(dá),從而參與調(diào)控真核細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)育,但目前對(duì)組蛋白修飾,尤其是乙?；揎検欠駞⑴c豬胚胎著床前期發(fā)育的研究極少。故本研究擬以H3K27ac為對(duì)象,檢測(cè)H3K27ac在體外受精胚(In vitro fertilization embyo,IVFE)、體細(xì)胞克隆胚(Nuclear transfer embryo,NTE)以及孤雌激活胚(Part

3、henogenetic activation embryo,PAE)等不同類(lèi)型豬著床前胚胎不同發(fā)育階段的表達(dá)量,進(jìn)而揭示同一類(lèi)型胚胎整個(gè)著床前發(fā)育階段的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律,通過(guò)比較不同類(lèi)型胚胎的變化趨勢(shì),關(guān)聯(lián)胚胎發(fā)育命運(yùn),為揭示H3K27ac在豬NTE早期發(fā)育期間的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
　　試驗(yàn)一:旨在揭示豬胚胎著床前發(fā)育期間H3K27ac的動(dòng)態(tài)變化譜。首先,對(duì)H3K27ac抗體特異性進(jìn)行了檢測(cè)。用競(jìng)爭(zhēng)性免疫多肽在豬孤雌囊胚上做驗(yàn)證,結(jié)果

4、顯示沒(méi)有H3K27ac信號(hào),表明本文所用抗體H3K27ac是特異性的。我們檢測(cè)了H3K27ac在NTE和PAE激活后第15min、30min和1h的表達(dá),根據(jù)NTE的H3K27ac水平,追蹤這一修飾的源頭;進(jìn)而以IVFE為參照,重點(diǎn)分析了豬NTE在2hpa、6hpa、12hpa、14hpa、16hpa、1cell、2cell、4cell、8cell、morula、EB、EXPB和HB時(shí)期的H3K27ac表達(dá)水平。結(jié)果如下:MII期卵母細(xì)

5、胞H3K27ac呈低水平,并一直持續(xù)到卵母細(xì)胞孤雌激活后30min,直到1h后H3K27ac水平才有升高的趨勢(shì)。核移植供體細(xì)胞H3K27ac水平很高,同第15min、30min、1h的NTE的H3K27ac水平相當(dāng)。在NTE 2hpa、6hpa、12hpa、14hpaH3K27ac表達(dá)水平很高,16hpa開(kāi)始減弱,4cell、8cell降至最低,morula時(shí)H3K27ac熒光信號(hào)有增強(qiáng)趨勢(shì),直到blastocyst增至最強(qiáng),這與PAE

6、和IVFE的H3K27ac表達(dá)模式相同,不同的是,NTEHB的H3K27ac水平減弱,同PAEHB,而IVFEHB依然維持穩(wěn)定高水平H3K27ac。結(jié)果表明,NTE的H3K27ac這一修飾來(lái)源于供體細(xì)胞,并且4cell、8cell階段H3K27ac的去除可能更有利于胚胎基因組激活。
　　試驗(yàn)二:目的是探討豬胚胎基因組激活前H3K27ac表達(dá)逐漸降低是否依賴(lài)于DNA復(fù)制、RNA轉(zhuǎn)錄和蛋白質(zhì)合成。首先,將孤雌激活后6h的卵母細(xì)胞分別經(jīng)

7、3μg.mL-1阿非迪霉素處理12h、25μg.mL-1鵝膏覃堿處理24h、50μg.mL-1放線(xiàn)菌酮處理24h后,再解除抑制,各自在新鮮PZM-3繼續(xù)培養(yǎng)24h、12h、12h,設(shè)置對(duì)照。結(jié)果發(fā)現(xiàn):三個(gè)處理組同對(duì)照組相比,H3K27ac水平相當(dāng)且很低,而孤雌激活后6h的卵母細(xì)胞H3K27ac水平很高。表明,H3K27ac去除是一個(gè)主動(dòng)的過(guò)程。
　　試驗(yàn)三:為探索H3K27ac乙酰化酶與去乙?；傅膭?dòng)態(tài)變化規(guī)律,我們收集了GV期和

8、MII期卵母細(xì)胞各20枚,IVFE、NTE和PAE的1cell、2cell、4cell和blastocyst胚胎各20枚。定量結(jié)果顯示:IVFE在1cell、2cell、4cell和blastocyst的HACD1、HACD2、CBP和MBD3要比NTE和PAE同時(shí)期胚胎相應(yīng)基因表達(dá)量高。其中,NTE中HACD2表達(dá)較高,且在4cell時(shí)期NTE的HACD2高于1cell、2cell和blastocyst的NTE的相應(yīng)基因的表達(dá)量。結(jié)果

9、表明,這種時(shí)空表達(dá)差異可以為更多的轉(zhuǎn)錄翻譯合成組蛋白去乙?；?使4cell、8cell時(shí)期H3K27ac能夠有效去除,似乎更利于胚胎基因組激活。
　　試驗(yàn)四:旨在研究組蛋白去乙?；敢种苿㏕SA對(duì)豬克隆胚胎早期發(fā)育的作用及分子機(jī)制。將重構(gòu)胚經(jīng)50nMTSA處理24h后,去除TSA,PZM-3繼續(xù)培養(yǎng),設(shè)置對(duì)照,2d、7d后分別觀(guān)察并記錄胚胎卵裂與囊胚發(fā)育情況并收集囊胚,免疫熒光。結(jié)果:TSA處理組明顯提高了囊胚率(42.5％±2

10、.8%vs.16.0%±3.7%)和總細(xì)胞數(shù)(77.4±4.9vs.54.0±7.6),且其處理組囊胚H3K27ac水平比對(duì)照組更接近體外受精的水平。表明:TSA能提高克隆囊胚的發(fā)育效率,并改善克隆囊胚H3K27ac水平。
　　綜上所述,本研究首次揭示了組蛋白H3K27ac修飾在豬早期胚胎全基因組表達(dá)模式,發(fā)現(xiàn)這種表達(dá)模式因豬早期胚胎類(lèi)型不同而有所差異,且豬胚胎基因組激活前H3K27ac的去除是一個(gè)主動(dòng)的過(guò)程,這種主動(dòng)的去除機(jī)制可