多能性基因的轉(zhuǎn)錄延伸是體細(xì)胞重編程的檢驗(yàn)點(diǎn).pdf

1、誘導(dǎo)型多能性干細(xì)胞具有胚胎干細(xì)胞的兩大特征，即自我更新能力和分化成幾乎機(jī)體的所有類(lèi)型細(xì)胞的能力。此外，誘導(dǎo)型多能性干細(xì)胞有望克服胚胎干細(xì)胞面臨的倫理問(wèn)題，在毒理學(xué)、藥物篩選、疾病模型及再生醫(yī)學(xué)中有廣闊的應(yīng)用前景。阻礙誘導(dǎo)型多能性干細(xì)胞應(yīng)用于臨床的主要問(wèn)題是效率和安全性，而解決這兩個(gè)問(wèn)題的關(guān)鍵是體細(xì)胞重編程的機(jī)理研究。體細(xì)胞重編程的過(guò)程涉及早期體細(xì)胞相關(guān)基因的沉默和后期多能性調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的激活。我們想從基因轉(zhuǎn)錄水平探究多能性基因是如何激活的。

2、
　　本研究首先比較了MEFs，重編程過(guò)程不同階段的細(xì)胞和iPSCs的RNA polⅡ的ChIP-Seq，發(fā)現(xiàn)RNA polⅡ在重編程的早期已經(jīng)結(jié)合在多能性基因的啟動(dòng)子附近但暫停在那里不能進(jìn)入轉(zhuǎn)錄延伸階段。P-TEFb是CDK9和cyclinT1/2/K組成的復(fù)合物，能夠磷酸化RNA polⅡ碳末端結(jié)構(gòu)域的二位絲氨酸殘基，從而調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄延伸。我們想通過(guò)調(diào)控P-TEFb來(lái)研究多能性基因的轉(zhuǎn)錄延伸在重編程中的作用。CDK9是P-T

3、EFb的催化亞基，我們首先在誘導(dǎo)重編程的過(guò)程中用shRNA抑制CDK9的表達(dá)，結(jié)果重編程被抑制。CDK9的抑制劑FP及CDK9的失活突變體CDK9 DN同樣抑制重編程。但抑制CDK9不影響AP+克隆的形成，盡管這些克隆為GFP-，暗示轉(zhuǎn)錄延伸主要在重編程的后期發(fā)揮作用。為了進(jìn)一步驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，我們構(gòu)建了可誘導(dǎo)表達(dá)的CDK9 DN，并在重編程的不同時(shí)期誘導(dǎo)其表達(dá)，發(fā)現(xiàn)只有在重編程后期表達(dá)CDK9 DN時(shí)才會(huì)抑制GFP+克隆的形成效率。此外

4、，qPCR結(jié)果顯示CDK9 DN抑制多能性基因的表達(dá)，而對(duì)MET相關(guān)基因沒(méi)有影響。但過(guò)表達(dá)CDK9不影響重編程的效率，推測(cè)可能P-TEFb的活性而非表達(dá)水平調(diào)控重編程。P-TEFb在細(xì)胞內(nèi)的活性受到嚴(yán)密的正負(fù)調(diào)控。BRD4能與CDK9相互作用而使之活化，HEXIM1，7SK RNA與之結(jié)合時(shí)則抑制其活性。我們發(fā)現(xiàn)在重編程過(guò)程中過(guò)表達(dá)BRD4可以促進(jìn)重編程，而用shRNA或BRD4的抑制劑JQ1處理細(xì)胞時(shí)則抑制重編程。通過(guò)構(gòu)建包含BRD4

5、不同結(jié)構(gòu)域的質(zhì)粒并與Yamanaka因子共表達(dá)，發(fā)現(xiàn)只有全長(zhǎng)的BRD4和包含BRD4-CTD的肽段能夠促進(jìn)重編程，并且過(guò)表達(dá)BRD4-CTD時(shí)促進(jìn)重編程的效果更顯著。這說(shuō)明BRD4促進(jìn)重編程是通過(guò)BRD4-CTD結(jié)構(gòu)域。此外，我們還構(gòu)建了BRD4及BRD4-CTD的突變體——突變BRD4-CTD結(jié)構(gòu)域中與CDK9相互作用的氨基酸殘基，突變的BRD4以及BRD4-CTD都不能促進(jìn)重編程，進(jìn)一步說(shuō)明BRD4促進(jìn)重編程是通過(guò)與P-TEFb相互

6、作用。通過(guò)構(gòu)建可誘導(dǎo)表達(dá)的BRD4-CTD，我們發(fā)現(xiàn)只有在后期表達(dá)BRD4-CTD才可以促進(jìn)重編程，這與CDK9在重編程后期發(fā)揮作用相一致。qPCR結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)BRD4以及BRD4-CTD時(shí)都能促進(jìn)多能性基因的表達(dá)，而不影響MET相關(guān)基因的表達(dá)。相反，重編程過(guò)程中用shRNA抑制BRD4表達(dá)時(shí)可抑制多能性基因的表達(dá);在ESCs中用shRNA抑制BRD4表達(dá)使其不能維持多能性狀態(tài)而分化。此外，我們發(fā)現(xiàn)BRD4-CTD能促進(jìn)人尿液細(xì)胞的重

7、編程。RNA polⅡ的ChIP-qPCR結(jié)果表明在重編程過(guò)程中過(guò)表達(dá)BRD4-CTD時(shí)，促進(jìn)RNA polⅡ在Nanog，Oct4，Utf1和Dppa2等多能性基因的編碼區(qū)的結(jié)合，暗示這些多能性基因的表達(dá)水平更高。此外，當(dāng)我們?cè)谥鼐幊痰倪^(guò)程中過(guò)表達(dá)HEXIM1時(shí)重編程被抑制，多能性基因的表達(dá)也被抑制;而用shRNA抑制HEXIM1表達(dá)時(shí)有相反的效應(yīng)?？偟膩?lái)說(shuō)，我們的研究表明P-TEFb調(diào)控的多能性基因的轉(zhuǎn)錄延伸是體細(xì)胞重編程的一個(gè)關(guān)鍵