三黃雞體細(xì)胞重編程及iPSC培養(yǎng)體系的優(yōu)化.pdf

1、誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(Induced pluripotent stem cell，iPSC)是通過(guò)將外源多能因子導(dǎo)入到已分化的細(xì)胞中，促進(jìn)多能基因表達(dá)，使細(xì)胞重編程而獲得多能性的一類細(xì)胞。iPSC與ESC(Embryonic Stem Cell)類似，具有分化成各種類型細(xì)胞和三個(gè)胚層的潛能。相比分離胚胎干細(xì)胞犧牲胚胎的局限性，iPS技術(shù)可以誘導(dǎo)多種來(lái)源的細(xì)胞，給研究人員提供了更多的研究材料，并規(guī)避了破壞胚胎等倫理問(wèn)題。iPSC技術(shù)應(yīng)用在禽類物

2、種上，可以促進(jìn)珍稀鳥類和優(yōu)良種禽的保種育種。本論文研究主要從廣西三黃雞體細(xì)胞出發(fā)誘導(dǎo)iPSC，并優(yōu)化iPSC的培養(yǎng)系統(tǒng)，為建立一套以干細(xì)胞為基礎(chǔ)的家禽保種育種平臺(tái)奠定基礎(chǔ)。研究主要分為三部分，分別為分離三黃雞體細(xì)胞、誘導(dǎo)重編程三黃雞胚成纖維細(xì)胞、雞iPSC的培養(yǎng)條件的優(yōu)化，結(jié)果如下:
　　(1)三黃雞體細(xì)胞分離。本實(shí)驗(yàn)分離三黃雞幼雞羽毛細(xì)胞，采用不同種類培養(yǎng)液、胰蛋白酶不同時(shí)間消化、不同濃度血清培養(yǎng)液分離培養(yǎng)羽毛細(xì)胞。發(fā)現(xiàn)胰蛋白酶

3、消化10分鐘，DMEM/F12培養(yǎng)液培養(yǎng)可以分離到羽毛細(xì)胞，但羽毛細(xì)胞傳代后增殖速度減慢趨向死亡。分離并得到三黃雞幼雞心、肝、肌肉組織、雞胚成纖維細(xì)胞。
　　(2)三黃雞胚成纖維細(xì)胞誘導(dǎo)重編程。采用含有Oct4、Sox2、Klf4、Lin28、c-Myc多能轉(zhuǎn)錄因子Piggybac轉(zhuǎn)座子脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染CEF細(xì)胞，轉(zhuǎn)染培養(yǎng)10天后沒(méi)有出現(xiàn)細(xì)胞克隆。使用含有不同Sox2、Lin28、Oct4、Nanog、c-Myc和Klf-4多能因子組

4、合的慢病毒載體感染CEF細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)Sox2、Lin28、Oct4、Nanog組合，Sox2、Oct4、c-Myc、Klf-4組合均可實(shí)現(xiàn)細(xì)胞重編程，誘導(dǎo)出堿性磷酸酶陽(yáng)性克隆。
　　(3)雞iPSC的培養(yǎng)系統(tǒng)的優(yōu)化。通過(guò)配制不同營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)液，改變培養(yǎng)液中添加BRL條件培養(yǎng)液比例、FGF濃度、LIF濃度，對(duì)比BRL、STO、MEF飼養(yǎng)層，對(duì)比昆明小鼠和ICR小鼠MEF飼養(yǎng)層，對(duì)比絲裂霉素C處理和物理輻射處理MEF飼養(yǎng)層，培養(yǎng)并觀察

5、雞iPSC的生長(zhǎng)狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)ICR小鼠MEF細(xì)胞經(jīng)絲裂霉素C處理制備飼養(yǎng)層適合雞iPSC生長(zhǎng)，ICR小鼠MEF細(xì)胞經(jīng)γ射線輻射處理制備飼養(yǎng)層需要在培養(yǎng)液中添加4-10ng/ml LIF才能維持iPSC的生長(zhǎng)，KM小鼠MEF細(xì)胞經(jīng)絲裂霉素C處理和γ射線輻射處理制備飼養(yǎng)層不適合在本實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)體系中培養(yǎng)iPSC。
　　綜上作述，本研究分離獲得了三黃雞體細(xì)胞并實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)重編程，優(yōu)化了雞iPSC的培養(yǎng)條件，保持細(xì)胞良好的生長(zhǎng)狀態(tài)，為利用i