黑熊體細胞培養(yǎng)及熊-牛體細胞克隆胚胎融合條件初探.pdf

1、熊的膽、肉、骨、皮等均可入藥。因此黑熊除具有觀賞價值外，還有較高的經(jīng)濟價值，也正是因為它具有較高的經(jīng)濟價值，導(dǎo)致種群數(shù)量急劇下降。已經(jīng)被列為國家重點保護的二類野生動物。
　　亞洲黑熊(Ursus thibetanus)，別名狗熊、黑瞎子，東北地區(qū)分布在黑龍江、沈陽、吉林的長白山，分類地位動物界→脊索動物門→哺乳綱→真獸亞綱→食肉目→熊科→黑熊。近年來亂砍濫伐日益嚴重，曾經(jīng)分布很廣的熊類棲息地變成孤立的小區(qū)，導(dǎo)致種群的分離，尤其長白

2、山地區(qū)棲息地消失最嚴重，亞洲黑熊基因和種質(zhì)保種迫在眉睫。
　　本研究分為兩個部分：第一部分為組織塊法和酶法結(jié)合建立黑熊耳部成纖維細胞系。包括原代培養(yǎng)，細胞純化，傳代培養(yǎng)液的選擇，生長曲線的繪制等。
　　第二部分為以亞洲黑熊成纖維細胞作為供核細胞，以延邊黃牛MII期去核的卵母細胞作為受體，以擠壓法去核，注入體細胞到卵黃周隙中，采用不同的融合電場強度、脈沖次數(shù)、脈沖時程對熊-?？寺∨咛ミM行融合，復(fù)合化學(xué)方法激活。結(jié)果以融合率、卵

3、裂率、4-細胞發(fā)育率、8-細胞發(fā)育率、16-細胞發(fā)育率和囊胚發(fā)育率計。結(jié)果如下：
　　1.通過組織塊法+酶法培養(yǎng)，成功獲得亞洲黑熊成纖維細胞系。
　　2.對純化后的第三代成纖維細胞進行群體倍增實驗，根據(jù)前后細胞密度的變化，通過計算，結(jié)果確定適合黑熊成纖維細胞系傳代的培養(yǎng)液血清濃度為10％.
　　3.通過繪制生長曲線研究了黑熊耳皮膚成纖維細胞的增殖規(guī)律，用 DMEM培養(yǎng)黑熊耳部成纖維細胞，傳代后滯留期較短，約有一天左右，

4、活細胞逐漸貼壁生長。此后進入對數(shù)生長期，延續(xù)六天左右。第八天細胞發(fā)生接觸抑制而開始死亡，細胞數(shù)量進入平臺期，維持三天左右，細胞逐漸脫落死亡，細胞數(shù)量有所下降；
　　4.使用1100 v／cm的融合電場后，16-細胞發(fā)育率為34.89%顯著高于其他三組（P<0.05）。
　　5.使用2次融合脈沖后，8-細胞發(fā)育率61.31%顯著高于其他兩組（P<0.05）。
　　6.脈沖時程為40μs時，4-細胞發(fā)育率75%顯著高于10