非基因重編程及生物模擬誘導(dǎo)促進(jìn)ADSC直接重編程為角膜內(nèi)皮細(xì)胞.pdf

1、第一部分 ROCK抑制劑對牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞球注射移植的影響
　　目的：3D球形培養(yǎng)和ROCK抑制劑對提高細(xì)胞活力，促進(jìn)細(xì)胞增殖有很好的作用，本研究的目的是探索ROCK抑制劑對牛角膜內(nèi)皮細(xì)胞（B-CECs）在體外的生長，可注射移植，以及球形3D培養(yǎng)的影響。
　　方法：采用胰酶消化法從屠宰場獲得的牛眼球中分離得到原代角膜內(nèi)皮細(xì)胞（B-CEC），采用多細(xì)胞微球具模型進(jìn)行 B-CEC的球形培養(yǎng)并利用細(xì)胞死活染色、EdU染色和CCK-8

2、檢測評估ROCK抑制劑對B-CEC球與B-CECs增殖和活性的影響。利用體外可注射移植實(shí)驗(yàn)分析ROCK抑制劑對B-CEC球在細(xì)胞培養(yǎng)板和仿生脫細(xì)胞角膜貼壁能力的影響，倒置顯微鏡和掃描電鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。結(jié)果：免疫熒光染色表明Y-23672不改變CECs的表型，但通過細(xì)胞死活染色實(shí)驗(yàn)、EdU染色實(shí)驗(yàn)和CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Y-23672可以顯著提高B-CECs與B-CEC球細(xì)胞的活性和增殖。采用多細(xì)胞微球具模型形成大小均勻的B-CEC球比單

3、散CECs有更高分化潛能。體外模擬移植可注射性實(shí)驗(yàn)顯示，經(jīng)Y-23672處理的成球一天移植到細(xì)胞板或脫細(xì)胞角膜貼壁5天的B-CEC球可以貼壁完全并成鋪路石樣的單層細(xì)胞，而無Y-23672處理的對照組B-CEC球接種后仍有細(xì)胞聚集。
　　結(jié)論：與2D培養(yǎng)相比較，3D培養(yǎng)法能使B-CEC球有更高的分化潛能；ROCK抑制劑可以提升球形培養(yǎng)B-CEC的活力，促進(jìn)球形培養(yǎng)的B-CEC的增殖、遷移，且不改變B-CEC固有的基因和蛋白的表達(dá)；我

4、們的研究結(jié)果表明3D瓊脂糖球形培養(yǎng)法結(jié)合ROCK抑制劑是形成含有角膜內(nèi)皮前體細(xì)胞和體外模擬移植可注射性B-CEC球?qū)槲磥鞢EC的治療有重要的應(yīng)用意義。
　　第二部分非基因重編程及生物模擬誘導(dǎo)促進(jìn)ADSC直接重編程為角膜內(nèi)皮細(xì)胞
　　目的：探索重組蛋白和小分子在模擬微重力條件下對促進(jìn)脂肪干細(xì)胞(ADSC)重編程成為角膜內(nèi)皮（CEC）樣細(xì)胞的影響，目標(biāo)是要了解重組蛋白質(zhì)，小分子和仿生環(huán)境的組合能否為促進(jìn)脂肪干細(xì)胞轉(zhuǎn)分化成為角膜

5、內(nèi)皮樣細(xì)胞建立起非基因直接重編程平臺(tái)系統(tǒng)。
　　方法：使用膠原酶消化法分離原代ADSC，并對細(xì)胞進(jìn)行表型的鑒定。利用帶有穿膜肽的重組重編程蛋白PTD-Oct4、PTD-Klf4、PTD-Sox2（PTD-OKS）以及小分子（Purmorphamine，RG108等重編程化合物）在模擬微重力反應(yīng)器（SMG）中進(jìn)行ADSC的重編程誘導(dǎo)。重編程后的ADSC在插入式共培養(yǎng)系統(tǒng)與絲裂霉素C處理的CEC以及角膜緣基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)并接種到脫細(xì)胞牛

6、角膜基質(zhì)進(jìn)一步培養(yǎng)，RT-PCR和免疫熒光鑒定直接重編程后細(xì)胞的基因、蛋白表達(dá)情況。
　　結(jié)果：通過流式細(xì)胞術(shù)，成脂成骨分化法鑒定ADSC。使用帶穿膜肽的重組重編程蛋白PTD-Oct4、PTD-Klf4、PTD-Sox2（PTD-OKS）以及小分子（Purmorphamine，RG108等重編程化合物）在模擬微重力反應(yīng)器（SMG）中誘導(dǎo)后，RT-PCR和免疫熒光分析表明ADSCs陽性表達(dá)Nanog和CD34。共培養(yǎng)后的ADSC接種

7、到脫細(xì)胞角膜上成熟后，細(xì)胞形態(tài)由紡錘樣變?yōu)槎嘟切?；免疫熒光顯示直接重編程后的ADSCs弱陽性表達(dá)CD31、AQP-1、ZO-1。
　　結(jié)論：ADSC經(jīng)過重組蛋白與小分子在模擬微重力條件下重編程誘導(dǎo)后，具有更高的分化潛能；與CEC以及角膜基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)分化后接種到脫細(xì)胞角膜上呈現(xiàn)鋪路石樣六角形細(xì)胞形態(tài)，且陽性表達(dá)角膜內(nèi)皮標(biāo)志物CD31、AQP-1、ZO-1。這些發(fā)現(xiàn)初步實(shí)現(xiàn)了ADSC直接重編程為CEC。我們的研究也首次表明SMG旋轉(zhuǎn)