攜帶VEGF165的腺病毒轉(zhuǎn)染骨髓基質(zhì)干細(xì)胞與煅燒骨復(fù)合的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、研究目的： 1.研究大鼠骨髓基質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)生長(zhǎng)特點(diǎn)和誘導(dǎo)條件下向成骨細(xì)胞分化的能力及其成骨特點(diǎn)。2.成功構(gòu)建攜帶血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子165(VEGF165)的重組腺病毒(Ad-VEGF165)，重組腺病毒轉(zhuǎn)染大鼠MSCs，觀察細(xì)胞內(nèi)VEGF165的表達(dá)情況以及重組腺病毒對(duì)MSCs生長(zhǎng)的影響。3.探索Ad-VEGF165轉(zhuǎn)染的MSCs在膠原中的生長(zhǎng)能力，以及VEGF165在膠原中的分泌狀況。4.觀察經(jīng)膠原涂層處理的煅燒骨(CC

2、B)對(duì)大鼠MSCs的貼附、增殖及分化的影響。5.觀察大鼠MSCs/煅燒骨/Ⅰ型膠原復(fù)合物修復(fù)顱骨骨缺損的能力。6.探索Ad-VEGF165轉(zhuǎn)染的MSCs和煅燒骨復(fù)合植入體內(nèi)異位成骨和血管再生的能力。 研究方法： 1.大鼠MSCs用全骨髓貼壁法培養(yǎng)，并經(jīng)礦化液誘導(dǎo)，行ALP、骨鈣素、Ⅰ型膠原的測(cè)定，以及行MSCs礦化結(jié)節(jié)形成能力檢測(cè)和細(xì)胞生長(zhǎng)曲線測(cè)定。2.構(gòu)建腺病毒穿梭質(zhì)粒pAdTrack-VEGF165,并轉(zhuǎn)化到事先電轉(zhuǎn)

3、化腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1的BJ5183感受態(tài)細(xì)胞中，成功構(gòu)建pAdEasy-VEGF165質(zhì)粒，并用pAdEasy-VEGF165轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，包裝成重組腺病毒顆粒，熒光顯微鏡下觀察綠色熒光表達(dá)。構(gòu)建成功的重組腺病毒轉(zhuǎn)染MSCs，行PT-PCR、免疫組化和ELISA，測(cè)定VEGF165的表達(dá)。3.Ad-VEGF165轉(zhuǎn)染的MSCs行DAPI標(biāo)記，與膠原混合并培養(yǎng)。行HE染色和免疫熒光觀察。4.煅燒骨表面以鼠尾膠原行涂層處理

4、，將礦化液誘導(dǎo)的MSCs滴加支架材料上，掃描電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，并繪制生長(zhǎng)曲線，檢測(cè)成骨細(xì)胞的ALP活性。5.大鼠顱骨上制作直徑8mm圓形全層骨缺損，用誘導(dǎo)培養(yǎng)的MSCs與煅燒骨粉/Ⅰ型膠原復(fù)合，填充骨缺損，植入4周和8周兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)處死大鼠，組織學(xué)觀察骨缺損修復(fù)情況。6.Ad-VEGF165轉(zhuǎn)染的大鼠MSCs與誘導(dǎo)分化的MSCs混合后滴加到煅燒骨/膠原支架材料上，體外培養(yǎng)7d后，植入原大鼠皮下和肌肉內(nèi)。分別于4周、8周處死動(dòng)物，觀察異位

5、成骨和血管再生情況。 研究結(jié)果： 1.MSCs為梭形，呈克隆性生長(zhǎng)。誘導(dǎo)培養(yǎng)的MSCsALP活性增高，并且骨鈣素和Ⅰ型膠原表達(dá)明顯增多，誘導(dǎo)的MSCs增殖能力較差。2.經(jīng)酶切檢測(cè)、基因測(cè)序及和綠色熒光觀察說(shuō)明成功的構(gòu)建了攜帶VEGF165的重組腺病毒(Ad-VEGF165)。Ad-VEGF165轉(zhuǎn)染MSCs后24h，可以在熒光顯微鏡下看到綠色熒光，行PT-PCR、免疫組化及ELISA檢測(cè)，證明轉(zhuǎn)染的MSCs能夠分泌VEG

6、F165。3.細(xì)胞在膠原中分布均勻，為梭形，并可以伸展和增殖，Ad-VEGF165轉(zhuǎn)染的MSCs在膠原中可以繼續(xù)分泌VEGF165。4.膠原涂層處理的煅燒骨細(xì)胞粘附數(shù)量多，生長(zhǎng)好，ALP活性高。5.誘導(dǎo)的MSCs與煅燒骨粉/Ⅰ型膠原修復(fù)顱骨缺損可見缺損邊緣和中間部分都有新骨形成。6.細(xì)胞與支架材料復(fù)合植入體內(nèi)表現(xiàn)明顯的異位骨形成能力，隨著植入時(shí)間的延長(zhǎng)，小的骨島逐漸融合為大的板層狀骨，表現(xiàn)出較好的異位成骨能力。材料周圍血管生長(zhǎng)較多。

7、 研究結(jié)論： 1.MSCs易于分離培養(yǎng)及體外擴(kuò)增，可以向成骨細(xì)胞分化，能夠作為骨組織工程的種子細(xì)胞。2.成功地構(gòu)建了攜帶VEGF165的重組腺病毒，它的轉(zhuǎn)染對(duì)MSCs的增殖能力無(wú)明顯影響，而且MSCs能分泌VEGF165。3.膠原是細(xì)胞生長(zhǎng)的良好的支架材料，為轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分泌VEGF165的體外研究提供方便的模型。4.膠原修飾后的煅燒骨具有良好的組織相容性，能明顯提高成骨細(xì)胞的貼附率和成骨細(xì)胞ALP活性。5.煅燒骨粉/Ⅰ型膠原