人角朊干細(xì)胞的免疫磁珠分選及siRNA干擾其CCL20表達(dá)的初步研究.pdf

1、目的： 1．從人包皮組織獲得角朊細(xì)胞，將其進(jìn)行體外無血清培養(yǎng)，探索其體外培養(yǎng)的生長特點(diǎn)。利于免疫磁珠細(xì)胞分選法(Magnetic Activated Cell Sorting，MACS)結(jié)合人胎盤Ⅳ型膠原粘附法從角朊細(xì)胞中分離出角朊干細(xì)胞后進(jìn)行無血清培養(yǎng)，尋求一種理想有效的人角朊干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)技術(shù)。 2．在本課題組前期已經(jīng)成功構(gòu)建兩種人CCL20基因特異性小干擾RNA(smallinterference RNA，si

2、RNA)重組慢病毒表達(dá)載體的基礎(chǔ)上，補(bǔ)充測序鑒定出一種人CCL20基因特異性siRNA重組慢病毒陰性對照載體。同時(shí)，將構(gòu)建的重組慢病毒載體以包裝細(xì)胞293FT包裝生產(chǎn)，最后以慢病毒顆粒感染人角朊細(xì)胞株HaCaT細(xì)胞和角朊干細(xì)胞，并初步檢測siRNA對于角朊細(xì)胞表達(dá)CCL20的干擾效果。 方法 1．按照Dispase酶一胰酶兩步消化法從人包皮組織獲得角朊細(xì)胞(Keratinocyte，KC)，以人胎盤Ⅳ型膠原按照5μg/c

3、m<'2>的密度包被培養(yǎng)瓶，將角朊細(xì)胞以無血清培養(yǎng)基(defined keratinocyte-serum free medium，DK-SFM)進(jìn)行體外原代及傳代培養(yǎng)，并觀察其生長形態(tài)變化、克隆形成，并對原代培養(yǎng)的KC中的KSC以細(xì)胞表面分子CD49f(整合素α<，6>)、CD71(轉(zhuǎn)鐵蛋白受體)、CD29(整合素β<,1>)做表型檢測。 2．以免疫磁珠法對KC細(xì)胞中的角朊干細(xì)胞(keratinocyte stem cells

4、，KSC)進(jìn)行分選，分析其分選的純度和比例，再結(jié)合人胎盤Ⅳ型膠原粘附法將分選所得的細(xì)胞進(jìn)行體外無血清培養(yǎng)，觀察其生長情況及克隆形成。 3．將含有CCCL20-siRNA慢病毒載體重組質(zhì)粒的大腸桿菌(escherichia coli，E．coli)的菌液以劃線法接種于含有Amp 60μg/ml的LB平板上，篩選出陽性菌落、擴(kuò)增后提取質(zhì)粒，進(jìn)行DNA測序鑒定。 4．重組慢病毒表達(dá)載體質(zhì)粒pHSER-CCL20-siRNA-G

5、FP-SIN、慢病毒包裝質(zhì)粒Lentipack和慢病毒包膜蛋白質(zhì)粒Lentienv按照一定比例混合，與轉(zhuǎn)染試劑jetPEI一同轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293FT，24h后觀察其熒光表達(dá)情況，并分別在48h、72h、96h后，收集含有慢病毒顆粒的培養(yǎng)基上清液，并保存在-80℃。 5．分別將慢病毒顆粒加入至培養(yǎng)至50-60％融合的HaCaT和人角朊干細(xì)胞，并設(shè)立空白對照組。24 h后，并在所有細(xì)胞中加入刺激因子TNF-α、IL-1β和DK-SF

6、M的混合液，使TNF-α和IL-1β的終濃度均為100ng/ml。48h后收集細(xì)胞上清液，進(jìn)行人CCL20的酶聯(lián)免疫吸附測定(Enzyme linked-immuno-sorbent assay，ELISA)，在酶標(biāo)儀上檢測其OD<,450>值。根據(jù)試劑盒中標(biāo)準(zhǔn)品的濃度-OD<,450>值，求出其擬合曲線和方程，將樣品OD<,450>值代入方程，得到樣品中CCL20的蛋白濃度。比較幾種慢病毒顆粒和對照組的CCL20濃度，初步評價(jià)siRN

7、A干擾對于TNF-α和IL-1β共同刺激下的人角朊細(xì)胞株HaCaT和角朊干細(xì)胞表達(dá)CCL20的下調(diào)作用。 結(jié)果 1．角朊細(xì)胞以無血清培養(yǎng)基可在體外穩(wěn)定培養(yǎng)35.13±7.59天，傳3.87±0.83代，原代細(xì)胞克隆形成時(shí)間為5.75±0.90天。原代與傳代細(xì)胞的克隆形成時(shí)間和傳代時(shí)間差異不明顯(P>0.05)，細(xì)胞經(jīng)傳代培養(yǎng)后細(xì)胞數(shù)無明顯增加。 2．CD49f、CD71直接免疫熒光雙重標(biāo)記的原代培養(yǎng)角朊細(xì)胞中CD

8、49f<'bri> CD71<'dim>細(xì)胞的比例為46.6±2.1％，CD29直接免疫熒光標(biāo)記原代培養(yǎng)角朊細(xì)胞的陽性率為65.8±2.3％。 3．新鮮的人角朊細(xì)胞懸液經(jīng)MACS法分選后所得的CD49f<'bri> CD71<'dim>細(xì)胞比率達(dá)(12.2±7.1)％。CD49f<'bri> CD71<'dim>細(xì)胞經(jīng)培養(yǎng)可見細(xì)胞為典型的上皮樣特征，呈鋪路石樣形態(tài)，高核漿比例，細(xì)胞緊密排列，輪廓清楚，折光性好，并可在5-7天左右

9、可形成全克隆，符合角朊干細(xì)胞的特點(diǎn)。 4．構(gòu)建的1種重組慢病毒陰性對照載體通過測序驗(yàn)證載體構(gòu)建成功。 5．成功利用293FT細(xì)胞包裝已經(jīng)構(gòu)建成功的重組載體質(zhì)粒，生產(chǎn)出慢病毒顆粒，觀察到其有較高的感染效應(yīng)。慢病毒顆粒感染HaCaT和角朊干細(xì)胞后通過人CCL20酶聯(lián)免疫吸附測定實(shí)驗(yàn)，初步觀察到兩種人CCL20基因特異性siRNA重組慢病毒表達(dá)載體對于人角朊細(xì)胞表達(dá)CCL20有一定的下調(diào)作用。 結(jié)論 1．對人K

10、C的體外無血清培養(yǎng)方法進(jìn)行了觀察，探索出了其體外無血清培養(yǎng)的生長特性和規(guī)律。 2．將MACS分選法與人胎盤Ⅳ型膠原粘附法相結(jié)合從皮膚組織的表皮細(xì)胞懸液中直接分離出較高比例的干細(xì)胞，在如何對KSC進(jìn)行大量純化的方法學(xué)上做了一次新的探索，為后續(xù)研究提供了新的備選技術(shù)路線。 3．補(bǔ)充測序驗(yàn)證成功了1種人CCL20基因特異性siRNA重組慢病毒陰性對照載體。 4．以TNF-α和IL-1β共同刺激感染了CCL20-siRN