磁珠分選半相合基因鼠效應細胞免疫治療黑色素瘤的研究.pdf

1、目的:本實驗以黑色素瘤B16細胞接種于C57BL/6雌鼠背部，建立小鼠黑色素瘤模型。體外應用C57BL/6鼠及半相合基因鼠CB6F1（BABL/C×C57BL/6的雜交子一代，雌性）脾臟來源的樹突狀細胞負載腫瘤全抗原與半相合效應性淋巴細胞共培養(yǎng)，隨后檢測效應細胞體外殺傷黑色素瘤效應。然后經(jīng)過磁珠分選純化后富集分泌IFN-γ的半相合效應細胞，將其作用于荷瘤C57BL/6雌鼠體內(nèi)，檢測純化后的半相合效應細胞對腫瘤微環(huán)境中炎性因子IL-2及I

2、FN-γ的影響，觀察各組小鼠腫瘤體積變化，生存期，GVHD程度，為腫瘤微環(huán)境干擾介導的細胞免疫治療技術(shù)在臨床的應用提供新的理論依據(jù)和實驗數(shù)據(jù)。
　　方法:
　　1.體外培養(yǎng)小鼠黑色素瘤B16細胞，建立C57BL/6小鼠黑色素瘤模型。
　　2.C57BL/6鼠及半相合基因鼠CB6F1來源負載全腫瘤抗原DC的制備:取C57BL/6、CB6F1小鼠骨髓細胞，體外貼壁分選后加入rmGM-CSF、rmIL-4、黑色素瘤B16細胞

3、凍融抗原，TNF-α誘導培養(yǎng)腫瘤抗原致敏的成熟DC(matured DC，mDC)。
　　3.磁珠分選效應性T細胞的制備:將CB6F1小鼠脾細胞，經(jīng)淋巴分離液分離獲得淋巴細胞，尼龍毛柱吸附法收集T淋巴細胞。培養(yǎng)T淋巴細胞2天后，加入腫瘤抗原致敏的成熟DC，混合培養(yǎng)3-4天，即可獲得腫瘤抗原刺激后的活化效應性T細胞。應用磁珠陽性分選方法富集上述活化半相合基因效應T細胞中分泌IFN-γ的半相合效應細胞。
　　4.CCK-8法檢測

4、三組效應性T細胞體外殺傷實驗:將（A組）CB6F1來源DC和（B組）C57BL/6來源DC及（C組）二者混合的DC誘導產(chǎn)生的CTL（作為效應細胞，E）分別與小鼠黑色素瘤B16細胞(作為靶細胞，T)按E∶T=50∶1、20∶1和10∶1的比例混合后孵育24 h，加入CCK-8試劑(20μL/孔)，酶標儀檢測各孔450 nm波長的A值，并計算效應性T細胞對腫瘤細胞的殺傷率。
　　5.實驗動物分組及治療:將荷瘤小鼠C57BL/6完全隨機

5、分至3組，每組40只。（A組）荷瘤對照組:每只荷瘤小鼠鼠尾靜脈注射0.2ml生理鹽水;（B組）環(huán)磷酰胺治療組:每只荷瘤小鼠腹腔注入(100mg/kg)環(huán)磷酰胺;（C組）磁珠分選純化半相合CTL治療組:每只荷瘤小鼠鼠尾靜脈注射0.2ml（1×106個/0.2ml）磁珠分選富集的IFN-γ陽性CB6F1來源效應性T細胞。觀察治療后各組荷瘤鼠腫瘤體積變化及生存期。
　　6.分別在細胞治療后的第1、4、7、10、14天取小鼠的血清，采用E

6、LISA法檢測觀察治療后血清中IL-2、IFN-γ含量及其變化，并比較不同治療方法對荷瘤鼠外周血中兩細胞因子產(chǎn)生的影響。
　　7.磁珠分選純化效應細胞治療后第14天，HE染色觀察各組小鼠瘤組織以及肝、脾和小腸組織的形態(tài)學變化。
　　結(jié)果:
　　1.C57BL/6小鼠經(jīng)皮下接種5×106 B16黑色素瘤細胞株7天后可見小鼠皮下明顯的黑色結(jié)節(jié)，直徑達0.5cm。
　　2.小鼠骨髓來源DC細胞培養(yǎng)至第6天，倒置相差顯微

7、鏡下觀察發(fā)現(xiàn)大量具有典型毛刺狀形態(tài)的成熟DC細胞懸浮在上清液中聚集成團，提示DC已經(jīng)發(fā)育成熟，具備提呈抗原能力。
　　3.CCK-8法檢測不同來源DC提呈腫瘤抗原激活產(chǎn)生的效應性T細胞體外殺傷效率:
　　效靶比為50∶1及20∶1條件下A組（CB6F1來源DC）誘導的效應性T細胞對B16細胞殺傷率優(yōu)于B組（C57BL/6來源DC）及C組(混合DC)，且差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)，B組及C組的殺傷率之間無顯著差別（P＞

8、0.05）;效靶比10∶1條件下A、B、C三組效應T細胞對B16細胞殺傷率比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。
　　4.各組荷瘤小鼠腫瘤體積變化:
　　單純注射PBS的對照組和環(huán)磷酰胺組小鼠腫瘤生長迅速，給予磁珠分選純化的半相合基因型DC-CTL過繼治療后，小鼠腫瘤生長速度從第7天至第20天較對照組顯著下降。
　　5.各組小鼠生存期:
　　A組（荷瘤對照組），B組（環(huán)磷化療組），C組（細胞治療組）間生存期比較，

9、差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。
　　6.ELISA法檢測治療后不同時間小鼠外周血中IL-2和IFN-γ的濃度:
　　在磁珠分選效應細胞治療組中血清IL-2及IFN-γ的含量明顯高于荷瘤對照組(P＜0.05)。荷瘤小鼠給予磁珠分選效應細胞治療后，血清IL-2和IFN-γ含量伴隨著時間的變化，出現(xiàn)逐漸升高的趨勢，三組外周血中IL-2的濃度均存在顯著性差異（P＜0.05）。
　　7.HE染色結(jié)果:各組荷瘤小鼠瘤組織內(nèi)壞死

10、面積，磁珠分選細胞治療組和環(huán)磷化療組明顯大于對照組;觀察磁珠分選細胞治療后小鼠肝、小腸、脾臟組織中未見明顯組織損傷形態(tài)學變化。
　　結(jié)論:
　　1.在體外實驗中，分別來源于CB6F1及C57BL/6的DC及兩種混合DC誘導的半相合基因效應性T細胞對小鼠黑色素瘤B16細胞均能產(chǎn)生殺傷效應，且CB6F1來源的DC誘導的半相合基因效應性T細胞的殺傷率明顯高于其他兩種誘導方式，另外兩種誘導方式之間的殺傷率未見統(tǒng)計學差異。
　　

11、2.與環(huán)磷化療組及荷瘤對照組比較，磁珠分選半相合基因型效應細胞治療組7至21天小鼠腫瘤生長速度顯著下降。說明磁珠分選的效應細胞對小鼠腫瘤生長具有明顯抑制作用，然而，環(huán)磷化療組與荷瘤對照組相比，其腫瘤生長抑制作用無統(tǒng)計學差異。
　　3.磁珠分選半相合基因效應性T細胞過繼免疫治療與環(huán)磷酰胺化療都能夠有效延長荷瘤C57BL/6小鼠的生存期，但磁珠分選細胞治療組的生存期明顯優(yōu)于環(huán)磷化療組。
　　4.磁珠分選半相合基因效應性T細胞過繼