綿羊CCL28和Granulysin基因的克隆與體外表達.pdf

1、CC趨化因子配體28(CCL28)，又稱黏膜相關上皮趨化因子(MEC)，是新近發(fā)現的CC趨化因子家族成員，在人和小鼠的大部分黏膜組織(唾液腺、乳腺、小腸、大腸和氣管)中表達，并且是由以上組織的上皮細胞產生℃CL28對IgA抗體分泌細胞(IgA-ASCs)的歸巢起重要作用，此外，CCL28還具有廣譜的抗微生物活性。 Granulysin是一種表達于人體細胞毒性T淋巴細胞(CTL)和自然殺傷細胞(NK Cells)中的一種抗菌蛋白

2、，屬于SAPLIP(saposin-like protein)家族的一類脂封閉蛋白，是目前CTL胞漿顆粒中唯一證實具有抗菌活性的效應分子。Granulysin能與穿孔素和顆粒酶共同定位于人的細胞毒性T淋巴細胞和自然殺傷細胞顆粒中，其作用相當于廣譜抗菌素，作用范圍包括革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、真菌和寄生蟲，Granulysin也能殺滅人的腫瘤細胞。 為了研究CCL28和Granulysin在綿羊體內是否具有同樣的功能，我們克隆

3、了綿羊CCL28和Granulysin基因，并得到了相應的融合蛋白，試驗分兩個系列。 一、綿羊CCL28基因的克隆與體外表達。利用同源序列克隆原理設計一對克隆引物，對綿羊結腸黏膜組織提取的總RNA行RT-PCR，將PCR產物與pMD19-T載體連接后轉化EcolJM109感受態(tài)細胞，篩選陽性克隆、測序，并進行序列分析；又根據克隆序列設計一對表達引物，用PCR法從重組克隆載體中擴增出含BamHI/Xhol酶切位點的CCL28片段

4、，雙酶切后亞克隆至pGEX-4T-1載體，構建重組原核表達載體pGEX-CCL28，轉化宿主菌E.coli BL21，經IPTG誘導進行表達，SDS-PAGE鑒定。克隆的綿羊CCL28基因包含完整的開放閱讀框架，長為444bp，ORF為387bp，編碼129個氨基酸，與人、小鼠、豬和牛該基因的同源性分別為76.4％、61.4％、84.3％和92.9％，推導的氨基酸序列與人、小鼠、豬和牛的同源性分別為76％、63％、84％和93％，信號肽

5、1～24aa，SCY功能域為27～88aa，結構特征與人、小鼠、豬和牛的CCL28相一致，成功構建了原核表達載體pGEX-CCL28，表達的融合蛋白分子量約為39ku，為進一步研究綿羊CCL28的生物學功能奠定了基礎。 二、綿羊Granulysin基因的克隆與體外表達?；陔娮友由煨蛄校O計一對克隆引物，對綿羊回腸黏膜組織提取的總RNA進行RT-PCR，將PCR產物與pMDl9-T載體連接后轉化Ec01.JMl09感受態(tài)細胞，

6、篩選陽性克隆、測序，并進行序列分析；又根據克隆序列設計一對表達引物，用PCR法從重組克隆質粒中擴增出含BamHI/XhoI酶切位點的Oranulysin片段，雙酶切后亞克隆至pGEX-4T-1載體，構建重組原核表達載體pGEX-Oranulysin，轉化宿主菌E.coli BL21，經IPTG誘導進行表達，SDS-PAGE鑒定。克隆的綿羊Granulysin基因包含完整的開放閱讀框架，長為509bp，ORF為438bp，編碼146個氨基