塑化劑有毒代謝物MEHP誘導(dǎo)自噬參與胰島INS-1細(xì)胞氧化性DNA損傷機(jī)制探討.pdf

1、目的：鄰苯二甲酸單（2-乙基己基）酯（Mono-(2-ethylhexyl) phthalate，MEHP）是鄰苯二甲酸（2-乙基己基）酯(di-(2-ethylhexyl) phthalate，DEHP)的有效毒性代謝產(chǎn)物。由于塑料產(chǎn)品中和日常飲食中DEHP越來越多的被使用，所以DEHP和其水解物MEHP對(duì)人體的傷害值得重視。已經(jīng)有研究表明鄰苯二甲酸酯類代謝物與很多慢性疾病有關(guān)，像肥胖和二型糖尿病等。而累積DNA損傷和一些氧化性損傷與

2、胰島素抵抗和肥胖的發(fā)生都有直接關(guān)系。近年來發(fā)現(xiàn)在DNA損傷的發(fā)生過程中還會(huì)檢測(cè)到自噬的發(fā)生，自噬的出現(xiàn)對(duì)細(xì)胞是有利還是有害不是完全清楚，其間作用的信號(hào)通路也不是很明朗。白藜蘆醇作為抗氧化劑可以消除細(xì)胞內(nèi)活性氧，達(dá)到化學(xué)預(yù)防的作用，對(duì)肥胖和糖尿病等慢性病有著積極的治療作用。所以在本實(shí)驗(yàn)中，探究MEHP對(duì)INS-1細(xì)胞造成的DNA損傷，分析造成DNA損傷的機(jī)制途徑，同時(shí)還探究自噬的發(fā)生與DNA損傷的關(guān)系及其對(duì)細(xì)胞的影響；選用白藜蘆醇作為保護(hù)

3、劑，觀察其在MEHP產(chǎn)生細(xì)胞毒性過程中的作用。
　　方法：INS-1細(xì)胞被選為研究對(duì)象。MTT實(shí)驗(yàn)用來檢測(cè)MEHP對(duì)INS-1細(xì)胞的毒性作用和對(duì)細(xì)胞生存率的影響；彗星實(shí)驗(yàn)用來評(píng)定MEHP對(duì)INS-1細(xì)胞的遺傳毒性、DNA損傷水平；實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)INS-1細(xì)胞內(nèi)DNA損傷相關(guān)基因ATM和P53的表達(dá)量變化。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS變化使用2',7'-二氯二氫熒光素?zé)晒馊玖?DCFH-DA)，檢測(cè)溶酶體膜穩(wěn)定性用吖啶橙（AO），檢測(cè)線

4、粒體膜電位變化用JC-1染色，使用分光光度計(jì)和熒光顯微鏡觀察拍照。用蛋白印跡法檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá)量變化。檢測(cè)白藜蘆醇和自噬抑制劑的作用都需要預(yù)先對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理，再加MEHP作用。
　　結(jié)果：與對(duì)照組相比，MEHP作用后INS-1細(xì)胞產(chǎn)生明顯的DNA損傷，表現(xiàn)為彗星實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞拖尾現(xiàn)象加劇等，MEHP還導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平升高、溶酶體膜穩(wěn)定性下降、溶酶體內(nèi)組織蛋白酶 B釋放增多、線粒體膜電位崩潰以及自噬蛋白表達(dá)增加。經(jīng)白藜蘆醇

5、預(yù)處理后上述現(xiàn)象均減輕，經(jīng)自噬抑制劑預(yù)處理后自噬蛋白表達(dá)減少，細(xì)胞內(nèi)ROS水平反而增多。
　　結(jié)論：MEHP對(duì)INS-1細(xì)胞具有遺傳毒性。MEHP誘導(dǎo)產(chǎn)生的INS-1細(xì)胞DNA損傷是氧化應(yīng)激造成的。MEHP誘導(dǎo)產(chǎn)生的INS-1細(xì)胞DNA損傷跟溶酶體-線粒體軸損傷有關(guān)。MEHP誘導(dǎo)產(chǎn)生INS-1細(xì)胞DNA損傷同時(shí)也誘導(dǎo)細(xì)胞自噬增加，而自噬對(duì)INS-1細(xì)胞在DNA損傷過程中起到一種保護(hù)作用。白藜蘆醇可以通過減輕氧化應(yīng)激和恢復(fù)溶酶體-線