同型半胱氨酸對(duì)人內(nèi)皮細(xì)胞的損傷機(jī)制及丹皮酚保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、近年來大量臨床和實(shí)驗(yàn)研究證明,同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)已成為致動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)的一種獨(dú)立的危險(xiǎn)因素[1],在心腦血管疾病及外周血管硬化等疾病發(fā)病機(jī)制中起重要作用。但Hcy致AS的具體機(jī)制尚不清楚,因此探討同型半胱氨酸誘導(dǎo)AS的發(fā)病機(jī)制具有十分重要的意義。
　　 丹皮酚作為傳統(tǒng)的中藥有效成分,具有廣泛的藥理活性,其中在心血管方面有抗AS,抗血栓,抗心律失常等作用[2]。目

2、前,已有資料表明丹皮酚在整體水平保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞,減輕AS的進(jìn)程,但丹皮酚在細(xì)胞水平保護(hù)Hcy所致AS的研究尚未見報(bào)道。本研究以Hcy為損傷因子建立內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型,觀察Pae對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human Umbilical VeinsEndothelial Cells,HUVECs)的保護(hù)作用,并探討其分子機(jī)制,為臨床應(yīng)用Pae防治動(dòng)脈粥樣硬化提供有價(jià)值的實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。
　　 第一部分同型半胱氨酸對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的損傷機(jī)

3、制研究
　　 目的:
　　 觀察同型半胱氨酸(Hcy)對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)NF-κB通路、eNOS及NO含量的影響,探討Hcy對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞損傷的可能的分子機(jī)制,為防治動(dòng)脈粥樣硬化提供新的治療靶點(diǎn)。
　　 方法:
　　 1.HUVECs的分離培養(yǎng):
　　 用0.1％Ⅰ型膠原酶與0.25％胰蛋白酶-0.02％EDTA等比混合消化液消化法收集HUVECs,加入含20％胎牛血清、20μg／L

4、bFGF的DMEM培養(yǎng)基在37℃、5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),用0.125％胰蛋白酶-0.01％EDTA進(jìn)行消化傳代培養(yǎng)。
　　 2.實(shí)驗(yàn)分組:
　　 實(shí)驗(yàn)用第2、3代細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分為正常對(duì)照組(HO),Hcy劑量組。正常對(duì)照組細(xì)胞加含20％胎牛血清、20gg／L bFGF的DMEM培養(yǎng)基；Hcy劑量組細(xì)胞在上述培養(yǎng)基基礎(chǔ)上再分為4組,分別加入2.5mmol／L Hcy(H1)、5mmol／L Hcy(H2)、10mmol／L

5、 Hcy(H3)及15mmol／L Hcy(H4)。各分組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24h。
　　 3.倒置顯微鏡觀察各組HUVECs細(xì)胞形態(tài)變化。
　　 4.MTT法檢測(cè)各組HUVECs細(xì)胞活力。
　　 5.RT-PCR檢測(cè)各組HUVECs NF-κB p65、eNOS mRNA的表達(dá)。
　　 6.Western blotting檢測(cè)各組HUVECs IκB-α、ICAM-1蛋白的表達(dá)。
　　 7.免疫組化法

6、檢測(cè)各組HUVECs中NF-κB p65核轉(zhuǎn)移的變化。
　　 8.硝酸還原酶法檢測(cè)各組HUVECs培養(yǎng)液中NO的含量。
　　 結(jié)果:
　　 1.HUVECs的分離培養(yǎng)
　　 原代培養(yǎng)的HUVECs呈典型的單層鋪路石樣或鵝卵石樣鑲嵌排列。傳代細(xì)胞的形態(tài)及生長(zhǎng)方式與原代培養(yǎng)細(xì)胞類似,匯合后細(xì)胞也呈單層鋪路石狀或鵝卵石樣鑲嵌排列。
　　 2.倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化如下:
　　 與正常對(duì)照組相

7、比,H1組細(xì)胞形態(tài)無明顯變化,H2組細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化,細(xì)胞收縮,間隙增寬,變圓。H3、H4組損傷作用明顯,細(xì)胞呈團(tuán)簇狀,輪廓不清.有較多細(xì)胞脫落。
　　 3.MTT法檢測(cè)各組HUVECs細(xì)胞活力
　　 與正常對(duì)照組比較,H1組細(xì)胞活力無明顯變化(P>0.05),無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；H2、H3、H4組細(xì)胞活力明顯下降(P<0.01)。
　　 4.RT-PCR檢測(cè)各組HUVECs NF-κB p65、eNOS mRNA的表

8、達(dá)
　　 4.1 NF-κB p65 mRNA的表達(dá):與正常對(duì)照組比較,Hcy各劑量組NF-κB p65mRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.05,P<0.01),且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性(P<0.05)。
　　 4.2 eNOS mRNA的表達(dá):與正常對(duì)照組比較,H1組eNOS mRNA表達(dá)無明顯變化,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。H2、H3、H4組eNOS mRNA的表達(dá)明顯減少(P<0.01),且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性(P<

9、0.05)。
　　 5.Western blotting檢測(cè)各組HUVECs IκB-α、ICAM-1蛋白的表達(dá)
　　 5.1 IκB-α蛋白的表達(dá):與正常對(duì)照組比較,Hcy各劑量組IκB-α蛋白的表達(dá)均明顯降低(P<0.05,P<0.01),且具有一定的劑量依賴性(P<0.05)。
　　 5.2 ICAM-1蛋白的表達(dá):與正常對(duì)照組比較,Hcy各劑量組ICAM-1蛋白的表達(dá)均明顯增多(P<0.05,P<0.01

10、)。
　　 6.免疫組化法檢測(cè)各組HUVECs細(xì)胞NF-κB p65核轉(zhuǎn)移變化
　　 NF-κB p65陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物為棕黃色顆粒。正常對(duì)照組中,NF-κB p65在細(xì)胞中基本無表達(dá)。H1組棕黃色顆粒較少,H2、H3、H4組棕黃色顆粒明顯增加,并且隨著Hcy濃度的增加,細(xì)胞核內(nèi)棕黃色顆粒明顯增多,表明具有明顯的核轉(zhuǎn)移傾向。與正常對(duì)照組比較,Hcy各劑量組NF-κB p65的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)。
　　 7.

11、硝酸還原酶法檢測(cè)各組HUVECs培養(yǎng)液中NO的含量
　　 與正常對(duì)照組比較,Hcy各劑量組HUVECs生成的NO逐漸減少(P<0.05,P<0.01),且呈現(xiàn)一定的劑量依賴性的關(guān)系(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.Hcy通過增強(qiáng)NF-κB p65 mRNA的表達(dá),加速IκB-a蛋白的降解,促進(jìn)NF-Bκ p65的釋放、活化,轉(zhuǎn)移進(jìn)細(xì)胞核,上調(diào)ICAM-1的表達(dá)。
　　 2.Hcy通過抑制eNOS

12、 mRNA的表達(dá),使eNOS合成減少,活性降低,進(jìn)而減少HUVECs內(nèi)NO的生成。
　　 第二部分丹皮酚對(duì)同型半胱氨酸損傷的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用的研究
　　 目的:
　　 采用人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)為研究對(duì)象,以同型半胱氨酸為損傷因子建立內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型,觀察Pae對(duì)同型半胱氨酸損傷的內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB通路、eNOS及NO含量的影響,探討Pae對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)作用及其抗動(dòng)脈粥樣硬化的分子機(jī)制。

13、>　　 方法:
　　 1.實(shí)驗(yàn)分組
　　 實(shí)驗(yàn)分為5組,正常對(duì)照組,Hcy損傷模型組(Hcy10mmol／L組),Pae低劑量組(10mmol／L Hcy+0.15mmol／L Pae),Pae中劑量組(10mmol／L Hcy+0.3mmol／L Pae),Pae高劑量組(10mmol／L Hcy+0.6mmol／L Pae)。
　　 2.倒置顯微鏡觀察各組HUVECs細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
　　 3.MT

14、T法檢測(cè)各組HUVECs細(xì)胞活力。
　　 4.RT-PCR法檢測(cè)各組HUVECs NF-κB p65、eNOS mRNA的表達(dá)。
　　 5.Western blotting檢測(cè)各組HUVECs IκB-α、ICAM-1蛋白的表達(dá)。
　　 6.免疫組化法檢測(cè)各組HUVECs中NF-κB p65核轉(zhuǎn)移的變化。
　　 7.硝酸還原酶法檢測(cè)各組HUVECs培養(yǎng)液中NO的含量。
　　 結(jié)果:
　　

15、1.倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)變化如下:
　　 與正常對(duì)照組比較,Hcy損傷模型組的細(xì)胞出現(xiàn)片狀分離,脫落現(xiàn)象。Pae保護(hù)組使細(xì)胞間隙變窄,形態(tài)趨于正常。
　　 2.MTT法檢測(cè)各組HUVECs細(xì)胞活力
　　 與正常對(duì)照組比較,Hcy損傷模型組細(xì)胞活力明顯降低(P<0.01)。與Hcy損傷模型組比較,Pae各劑量組的細(xì)胞活力明顯升高(P<0.01),且具有一定的劑量依賴性(P<0.05)。
　　 3.RT-P

16、CR檢測(cè)各組HUVECs NF-κB p65、eNOS mRNA的表達(dá)
　　 3.1 NF-κB p65 mRNA的表達(dá):與正常對(duì)照組比較,Hcy損傷模型組NF-κB p65 mRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01)。與Hcy損傷模型組比較,Pae各劑量組(低、中、高)的NF-κB p65 mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05,P<0.01),并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性(P<0.05)。
　　 3.2 eNOS mRNA的表達(dá):

17、與正常對(duì)照組比較,Hcy損傷模型組eNOSmRNA的表達(dá)明顯降低(P<0.01)。與Hcy損傷模型組比較,Pae各劑量組(低、中、高)的eNOS mRNA的表達(dá)明顯增強(qiáng)(P<0.01),并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性(P<0.05)。
　　 4.Western blotting檢測(cè)各組HUVECs IκB-α、ICAM-1蛋白的表達(dá)
　　 4.1 IκB-α蛋白的表達(dá):與正常對(duì)照組比較,Hcv損傷模型組IκB-α蛋白表達(dá)明顯降低

18、(P<0.01)。與Hcy損傷模型組比較,Pae各劑量組(低、中、高)IκB-α蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)。
　　 4.2 ICAM-1蛋白的表達(dá):與正常對(duì)照組比較,Hcy損傷模型組ICAM-1蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.01)。與Hcy損傷模型組比較,Pae各劑量組(低、中、高)ICAM-1的表達(dá)逐漸降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,P<0.01)。
　　 5.免疫組化法檢測(cè)各組HUVECs中NF-κB p6

19、5核轉(zhuǎn)移的變化
　　 Hcy損傷模型組中胞質(zhì)和胞核中均有棕黃色顆粒。與正常對(duì)照組比較,差異有顯著性(P<0.01)。Pae低劑量組中胞核內(nèi)仍有大量棕黃色顆粒,Pae中劑量組中胞核內(nèi)的棕黃色顆粒明顯減少,Pae高劑量組中,胞核中幾乎無棕黃色顆粒。與Hcy損傷模型組比較,Pae各劑量組在細(xì)胞核內(nèi)NF-κB p65的陽(yáng)性表達(dá)產(chǎn)物明顯減少(P<0.01)。
　　 6.硝酸還原酶法檢測(cè)各組HUVECs培養(yǎng)液中NO的含量
　　

20、 與正常對(duì)照組比較,Hcy損傷模型組HUVECs生成的NO明顯減少(P<0.01)。與損傷模型組比較,Pae各劑量組NO的含量明顯升高(P<0.05,P<0.01),并呈現(xiàn)一定的劑量依賴性(P<0.05)。
　　 結(jié)論:
　　 1.Pae對(duì)同型半胱氨酸損傷的內(nèi)皮細(xì)胞具有保護(hù)作用。
　　 2.Pae通過降低同型半胱氨酸損傷的內(nèi)皮細(xì)胞中NF-κB p65 mRNA表達(dá),抑制NF-κB的活化,下調(diào)ICAM-1蛋白的表