冠心康對同型半胱氨酸致血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:(1)通過對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVEC)的原代培養(yǎng)、傳代及凍存與復(fù)蘇，以及含中藥冠心康藥物血清的制備，為進(jìn)一步研究中藥防治AS的機(jī)制提供充足的實(shí)驗(yàn)材料。(2)通過觀察同型半胱氨酸對HUVEC的刺激作用，探討Hcy誘導(dǎo)HUVEC細(xì)胞凋亡的作用機(jī)制。(3)觀察冠心康藥物血清干預(yù)Hcy作用的HUVEC后各項(xiàng)指標(biāo)的變化，探討中藥冠心康防治Hcy致AS的作用機(jī)制。 方法:(1)應(yīng)用胰酶消化法，將人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分離下來，并用含20

2、％胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，在細(xì)胞達(dá)到80％融合后，消化傳代，并將獲得的細(xì)胞進(jìn)行鑒定與凍存；應(yīng)用中藥血清藥理學(xué)的方法，制備含不同中藥藥物濃度的藥物血清。(2)將獲得的HUVEC隨機(jī)分為6組，即為空白對照組、0.01mmol/LHcy組、0.1mmol/LHcy組、1.0mmol/LHcy組、2.0mmol/LHcy組、3.0mmol/LHcy組，然后分別在3h、6h、12h、24h測定細(xì)胞的凋亡率、線粒體膜電位及作用24h時內(nèi)質(zhì)

3、網(wǎng)伴侶蛋白Grp78蛋白表達(dá)水平的變化。(3)將獲得的HUVEC隨機(jī)分為5組，分別為：空白對照組、模型對照組、冠心康低濃度組、冠心康中濃度組、冠心康高濃度組；在冠心康作用2h后，每組細(xì)胞分別加入3.0mmol/L的Hcy，分別作用3h、6h、12h和24h，觀察血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率、線粒體膜電位、Grp78蛋白表達(dá)水平的不同以及細(xì)胞內(nèi)ROS和LOX-1蛋白表達(dá)的變化。 結(jié)果:(1)經(jīng)過鑒定，證明獲得的細(xì)胞為HUVEC，細(xì)胞生長狀

4、態(tài)良好，凍存復(fù)蘇后的細(xì)胞其生長情況與未凍存的細(xì)胞無差別；并制備出含不同藥物濃度的中藥血清。(2)在0.1mmol/LHcy作用6h后，細(xì)胞凋亡率明顯升高，線粒體膜電位降低明顯，其結(jié)果隨Hcy濃度的增加、作用時間的延長而逐漸差異顯著，與空白對照組比較有顯著差異(P＜0.05)；Grp78的蛋白表達(dá)在0.1mmol/L開始表達(dá)上調(diào)，并呈濃度依賴性，于3.0mmol/L，達(dá)到高峰。(3)模型組細(xì)胞細(xì)胞凋亡率顯著增高，線粒體膜電位下降顯著，Gr

5、p78的蛋白表達(dá)明顯上調(diào)，內(nèi)皮細(xì)胞內(nèi)ROS升高，LOX-1表達(dá)上調(diào)，與空白組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)；在中、高濃度的冠心康干預(yù)下，血管內(nèi)皮細(xì)胞的細(xì)胞凋亡率顯著下降，線粒體膜電位下降減低，Grp78的蛋白表達(dá)降低，ROS生成減少，LOX-1的蛋白表達(dá)下調(diào)，與模型組比較有顯著差異(P＜0.01)，且隨著作用時間的延長，作用越顯著。 結(jié)論:(1)應(yīng)用酶消化法，可以獲得HUVEC，并可以通過技術(shù)將其進(jìn)行凍存與復(fù)蘇；應(yīng)用血清藥理學(xué)

6、的原理，能制備含不同濃度的中藥藥物血清，為進(jìn)一步研究打下基礎(chǔ)。(2)Hcy能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡及Grp78蛋白水平的表達(dá)上調(diào)，其結(jié)果呈濃度、作用時間依賴性，說明其作用機(jī)制可能是引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)未折疊蛋白堆積，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)伴侶蛋白表達(dá)上調(diào)所致。(3)冠心康能夠拮抗同型半胱氨酸對血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷作用，且與冠心康的濃度、作用時間呈正性依賴關(guān)系；其作用機(jī)制可能是冠心康通過抑制同型半胱氨酸誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而降低內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率，減