同型半胱氨酸對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞組織因子表達(dá)的影響及染料木黃酮的干預(yù)作用.pdf

1、第一部分同型半胱氨酸對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)組織因子水平的影響 目的:研究同型半胱氨酸對(duì)原代培養(yǎng)的人大隱靜脈內(nèi)皮細(xì)胞組織因子(TF)表達(dá)水平的影響。 方法:采用酶消化法法原代培養(yǎng)人大隱靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，通過(guò)Ⅷ因子免疫熒光法對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。選擇生長(zhǎng)良好的第3-4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。分為：(1)空白對(duì)照組：1640培養(yǎng)基；(2)Hcy濃度組：不同濃度的同型半胱氨酸(10、20、50、80、100μmol/

2、L，)培養(yǎng)細(xì)胞24h；(2)Hcy時(shí)間組：50μmol/L的同型半胱氨酸，培養(yǎng)不同的時(shí)間(2、4、8、24、48、72h)。各培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞，經(jīng)藥物干預(yù)后收集細(xì)胞及培養(yǎng)上清液，采用LDH試劑盒檢測(cè)各組培養(yǎng)上清液中LDH的活性，采用RT-PCR技術(shù)測(cè)定細(xì)胞中TF mRNA的表達(dá)，用ELISA方法檢測(cè)上清液中TF水平。 結(jié)果: 1.正常細(xì)胞生長(zhǎng)良好，呈扁平多角形，邊界清楚，胞質(zhì)豐富，核圓形或橢圓形，居中，偶見(jiàn)雙核，隨細(xì)胞密度

3、增加呈現(xiàn)“鋪路石樣”排列；熒光顯微鏡下可見(jiàn)細(xì)胞胞漿內(nèi)均呈現(xiàn)綠色熒光，即胞漿內(nèi)表達(dá)Ⅷ因子，符合內(nèi)皮細(xì)胞特征。 2.加入同型半胱氨酸后細(xì)胞粗糙，邊界不整齊；同型半胱氨酸各濃度組的LDH活性都顯著高于空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；同型半胱氨酸不同作用時(shí)間組，從4小時(shí)組開(kāi)始，LDH活性逐漸增高，與空白對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表明同型半胱氨酸同型半胱氨酸有直接的細(xì)胞毒作用。 3.給予不同濃度同型半胱氨酸(10、20、50、80

4、、100μmol/L)刺激24小時(shí)后，人大隱靜脈內(nèi)皮細(xì)胞TFmRNA及上清液中TF表達(dá)水平隨同型半胱氨酸濃度的增加而升高，即同型半胱氨酸干預(yù)與內(nèi)皮細(xì)胞TF表達(dá)有劑量-效應(yīng)關(guān)系，呈劑量依賴(lài)性。 4.給予同型半胱氨酸50μmol/L作用于人大隱靜脈內(nèi)皮細(xì)胞不同時(shí)間，TF的表達(dá)從4小時(shí)開(kāi)始升高，隨刺激時(shí)間的延長(zhǎng)，TF的表達(dá)持續(xù)升高，于72小時(shí)達(dá)到最高，即呈時(shí)間依賴(lài)性。 第二部分染料木黃酮對(duì)同型半胱氨酸誘導(dǎo)TF表達(dá)的干預(yù)作用

5、 目的:研究染料木黃酮對(duì)同型半胱氨酸同型半胱氨酸誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)TF的干預(yù)作用。 方法:將細(xì)胞隨機(jī)分組：(1)空白對(duì)照組；(2)Hcy組：50μmol/L的同型半胱氨酸，培養(yǎng)細(xì)胞24h；(3)染料木黃酮組：染料木黃酮(5，10,20,40,50mg/L)，培養(yǎng)細(xì)胞24h；(4)染料木黃酮+Hcy組：染料木黃酮作用1h后再加入同型半胱氨酸(50μmol/L)，培養(yǎng)不同時(shí)間(2、4、8、12、24、48、72h)后收集細(xì)胞。MT

6、T法觀察染料木黃酮藥物對(duì)細(xì)胞增殖的影響，RT-PCR技術(shù)測(cè)定細(xì)胞中TFmRNA的表達(dá)，ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液中TF濃度。 結(jié)果： 1.不同濃度的染料木黃酮，分別作用6、12、24、48、72h，同對(duì)照組相比，細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯變化。說(shuō)明干預(yù)藥物本身對(duì)細(xì)胞沒(méi)有毒性作用。 2.用不同濃度的染料木黃酮預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞1h后，再加入同型半胱氨酸50μmol/L共孵育24小時(shí)，染料木黃酮對(duì)同型半胱氨酸所誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞培

7、養(yǎng)液中TF濃度的抑制，呈明顯的量效關(guān)系。共孵育12小時(shí)，染料木黃酮對(duì)同型半胱氨酸所誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞TFmRNA的抑制，呈明顯的量效關(guān)系。 3.40mg/L染料木黃酮預(yù)處理內(nèi)皮細(xì)胞1h后，再加入同型半胱氨酸50μmol/L共孵育不同時(shí)間，染料木黃酮對(duì)同型半胱氨酸誘導(dǎo)TF蛋白表達(dá)水平的抑制具有明顯的時(shí)間依從性，8小時(shí)開(kāi)始,48小時(shí)抑制作用達(dá)高峰。染料木黃酮對(duì)同型半胱氨酸誘導(dǎo)TFmRNA表達(dá)水平的抑制具有明顯的時(shí)間依從性，4小時(shí)開(kāi)始,2