體外波動(dòng)葡萄糖對(duì)HIT-T15細(xì)胞線粒體的氧化應(yīng)激損傷機(jī)制的初探.pdf

1、研究目的：觀察體外波動(dòng)葡萄糖對(duì)培養(yǎng)的HIT-T15細(xì)胞胰島素分泌、線粒體膜電位、細(xì)胞內(nèi)ATP含量、脂質(zhì)過氧化物水平及活性氧簇的影響，初探波動(dòng)的葡萄糖對(duì)胰島β細(xì)胞氧化應(yīng)激的可能損傷機(jī)理。 對(duì)象與方法：以SV40病毒轉(zhuǎn)化的敘利亞倉鼠胰島B細(xì)胞株HIT-T15細(xì)胞作為研究載體，實(shí)驗(yàn)分為：(1)5.5mM葡萄糖培養(yǎng)作為對(duì)照組；(2)持續(xù)高濃度葡萄糖(16.7mM)組；(3)5.5mM-16.7mM的葡萄糖交替(波動(dòng))干預(yù)組；(4)N-已

2、酰半胱氨酸(抗氧化劑)+持續(xù)高濃度葡萄糖培養(yǎng)組：(5)N-已酰半胱氨酸+波動(dòng)葡萄糖培養(yǎng)組。所有組干預(yù)72小時(shí)后，采用1．二氯熒光素雙醋酸鹽(2’，7’-H<,2>DCFDA)作為熒光探針，流式細(xì)胞儀測(cè)定HIT-T15細(xì)胞線粒體活性氧簇(ROS)的水平，2．硫代巴比妥酸法測(cè)量丙二醛含量。3．羅丹明染色線粒體，激光共聚焦顯微鏡測(cè)量線粒體膜電位，4．熒光素酶方法檢測(cè)ATP絕對(duì)水平，5．放免法測(cè)定基礎(chǔ)及高糖介導(dǎo)的胰島素分泌水平。 結(jié)果：

3、(1)體外波動(dòng)葡萄糖干預(yù)組和持續(xù)高糖組分別與正常對(duì)照組相比其基礎(chǔ)胰島素分泌無明顯差異，但高糖刺激后兩兩組胰島素分泌(GSIS)的增加量明顯減少(5.18±0.95 Vs 9.33±0.62ulU／ml：3.13±1.11 Vs 9.33±0.62ulU／ml，P(0.05)，持續(xù)高糖組的胰島素分泌增加量較波動(dòng)葡萄糖干預(yù)組更低(3.13±1.11 Vs 5.18±0.95 P<0.05)。經(jīng)抗氧化劑NAC處理后波動(dòng)葡萄糖干預(yù)組GSIS增加

4、量有所恢復(fù)，但與未加NAC組無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(6.22±0.48 Vs 5.18±0.95 uIU／ml，P>0.05)；持續(xù)高糖干預(yù)組經(jīng)抗氧化劑NAC處理后則GSIS增加量明顯升高(5.52±1.25 Vs 3.13±1.11 uIU／ml，P<0.05)，但兩組GSIS增加量仍低于NC組(6.22±0.48 Vs 9.33±0.62ulU/ml；5.52±1.25 Vs 9.33±0.62uIU／m1，P<0.05)。(2)波動(dòng)葡萄糖干

5、預(yù)組和持續(xù)高糖干預(yù)組分別與正常對(duì)照組相比，丙二醛(MDA)水平顯著升高(5.02±1.93 Vs 1.39±0.34 nmol／mgprot；4.46±1.80 Vs1.39±0.34 nmol／mgprot，P<0.05)，但兩組之間比較無明顯差異(P>0.05)，使用NAC處理后，MDA水平較處理前下降(1.34±0.89 Vs 5.02±1.93 nmol／mgprot；1.18±0.60 Vs 4.46±1.80 nmol／mg

6、prot，P<0.05)。(3)波動(dòng)葡萄糖干預(yù)組和持續(xù)高糖干預(yù)組分別與正常對(duì)照組相比，ROS水平(單位：以平均熒光強(qiáng)度表示)明顯升高(1.40±0.03 Vs 0.86±0.11；1.04±0.12 Vs 0.86±0.11，P<0.05)，并且波動(dòng)葡萄糖干預(yù)組較持續(xù)高糖干預(yù)組產(chǎn)生更多ROS(1.40±0.03 Vs 1.04±0.12，P<0.05)，NAC能部分降低持續(xù)高糖干預(yù)組ROS水平(0.91±0.18 Vs 1.04±0.1

7、2，P>0.05)；而波動(dòng)葡萄糖干預(yù)組經(jīng)抗氧化劑NAC處理后ROS則顯著減少(1.11±0.12 Vs 1.40±0.03，P<0.05)。(4)波動(dòng)葡萄糖干預(yù)組和持續(xù)高糖干預(yù)組分別與正常對(duì)照組相比，細(xì)胞內(nèi)ATP含量明顯下降(27.44±6.49 Vs 36.33±2.71pmol／mgprot；27.07±2.31 Vs 36.33±2.71pmol／mgprot，P<0.05)，波動(dòng)葡萄糖干預(yù)組ATP水平略高，但兩組之間無明顯差異(

8、27.44±6.49 Vs27.07±2.31pmol／mgprot，P>0.05)；經(jīng)NAC處理后，ATP含量有所增加，但無統(tǒng)汁學(xué)意義(34.72±6.29 Vs 27.44±6.49pmol／mgprot；27.82±3.75 Vs27.07±2.31 pmol／mgprot，P>0.05)。(5)波動(dòng)葡萄糖下預(yù)組和持續(xù)高糖干預(yù)紕分別與正常對(duì)照組相比，線粒體膜電位(單位：以相對(duì)熒光強(qiáng)度表示)明顯降低(69.07±16.92 Vs 1

9、07.99±13.49；66.29±5.51 Vs 107.99±13.49，P<0.01)，但兩組之間仍無顯著差異，波動(dòng)葡萄糖干預(yù)組膜電位稍高，NAC干預(yù)后膜電位無明顯改變(65.03±17.84 Vs 69.07±16.92，77.78±9.36 Vs 66.29±5.51，P>0.05)。 結(jié)論：體外波動(dòng)的葡萄糖與持續(xù)高糖對(duì)培養(yǎng)的HIT-T15細(xì)胞均能產(chǎn)生糖毒性作用，使β細(xì)胞的糖刺激后胰島素分泌減少。其機(jī)制可能是線粒體氧