低濃度血清法培養(yǎng)純化新生大鼠雪旺細胞.pdf

1、雪旺細胞(Schwann cell，SCs)是周圍神經(jīng)系統(tǒng)一種重要的膠質(zhì)細胞，能夠形成有髓和無髓神經(jīng)纖維的神經(jīng)內(nèi)膜組織，具有多種的生理學功能，增生的雪旺細胞能夠產(chǎn)生和分泌多種的能夠促進神經(jīng)損傷后神經(jīng)再生修復的神經(jīng)營養(yǎng)因子和細胞粘附分子等。在神經(jīng)的再生過程中，雪旺細胞可以通過吞噬變性的軸突和髓鞘碎屑、分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子（包括NGF，BDNF等）、分泌層粘連蛋白等多種基底膜成份等途徑，為近端軸突的再生提供一個良好的再生微環(huán)境，引導軸突再生

2、。隨著組織工程技術的發(fā)展，在能夠構建神經(jīng)導管的支架材料上種植雪旺細胞，移植人體可以促進軸突的快速生長，進一步的促進神經(jīng)修復，但是如何能夠快速與大量的獲得純度高、狀態(tài)好的雪旺細胞是移植成功與否的關鍵。
　　 目的：1．探討分離，培養(yǎng)，SD大鼠雪旺細胞的方法。2．利用低濃度血清培養(yǎng)基純化體外培養(yǎng)的新生大鼠的雪旺細胞。3．觀察和檢測低濃度血清處理后的雪旺細胞生物學性狀和神經(jīng)因子分泌能力的影響。
　　 方法：1．取新生3-7日的

3、SD大鼠雙側坐骨神經(jīng)，顯微鏡下將神經(jīng)剪碎至1mm3左右大小的神經(jīng)碎塊，利用雙酶消化法分離培養(yǎng)，光鏡觀察細胞形態(tài)及細胞生長情況。6天后分別以含有胎牛血清濃度為10％、2%及無血清DMEM培養(yǎng)基處理原代培養(yǎng)的雪旺細胞6天后，終止培養(yǎng)，并收集細胞。2．分別取原代培養(yǎng)及處理過后的雪旺細胞，采用免疫組化技術：以SABC方法標記雷旺細胞的特異性標記性蛋白S100，并在200倍顯微視野下以細胞計數(shù)方式分別統(tǒng)計雪旺細胞及成纖維細胞數(shù)，從而得到雪旺細胞的

4、純度即雪旺細胞數(shù)/雪旺細胞＋成纖維細胞數(shù)，獲得數(shù)據(jù)以t檢驗方法進行比較；流式細胞儀檢測細胞增值比率：在終止細胞培養(yǎng)時，以0.25%胰酶消化細胞，并以70%無水乙醇固定細胞，利用流式細胞儀分析得到S期、G2期的比率并進行統(tǒng)計學分析；利用RT-PCR法NGF、BDNF的mRNA在細胞內(nèi)的表達情況：在終止處理后，以Trizol提取液方法提取細胞的總RNA以β-肌動蛋白(β-actin)做內(nèi)標準，利用反轉錄一多聚酶鏈反應(RT-PCR)對A組和

5、B組的NGF、BDNF的mRNA進行擴增，取PCR產(chǎn)物行1%瓊脂糖凝膠電泳，測量其灰度值，分別計算NGF、BDNF和內(nèi)標基因(β-actin)PCR產(chǎn)物的灰度比值半定量和NGF、BDNF;統(tǒng)計學分析：數(shù)據(jù)采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。
　　 結果：1．以2%濃度血清DMEM培養(yǎng)基分離培養(yǎng)純化后，雪旺細胞的狀態(tài)好，統(tǒng)計學結果分析表明其純度達到96.9%以上。2．處理后的細胞S100蛋白表達穩(wěn)定，各組之間的細胞周期S期、