大鼠嗅成鞘細(xì)胞和雪旺細(xì)胞基因表達(dá)差異的研究.pdf

1、近年來對中樞神經(jīng)系統(tǒng)再生能力的認(rèn)識逐漸深入,發(fā)現(xiàn)移植外周神經(jīng)雪旺細(xì)胞(Schwann cells SCs)、嗅成鞘細(xì)胞(Olfactory ensheathing cells OECs)均可以促進(jìn)中樞軸突再生,并且發(fā)現(xiàn)OECs脊髓移植促軸突再生效果優(yōu)于 SCs,表現(xiàn)在再生軸突的延伸距離、電生理及支持體重和運(yùn)動功能的恢復(fù)等方面.OECs抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)的能力和較強(qiáng)的細(xì)胞遷移能力可能起了一定的作用,可能還有另外的一些未被發(fā)現(xiàn)的因素在同時

2、起作用.嗅覺系統(tǒng)終生保持著神經(jīng)再生的能力,嗅神經(jīng)元存活周期為4-8周,衰老的神經(jīng)元由嗅上皮產(chǎn)生的新生神經(jīng)元取代,重新發(fā)出軸突進(jìn)入中樞的嗅球與靶細(xì)胞形成突觸.OECs是伴隨嗅神經(jīng)形成髓鞘的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞,與嗅神經(jīng)再生進(jìn)入嗅球同靶細(xì)胞形成突觸密切相關(guān),.OECs在形態(tài)結(jié)構(gòu)和功能上與SCs極為相似,體外培養(yǎng)兩者均可呈梭形,可以形成髓鞘,都可以分泌多種神經(jīng)營養(yǎng)因子如神經(jīng)生長因子(nerve growth factor NGF)、腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子

3、(brain derived neurotrophic factor BDNF)和睫狀神經(jīng)生長因子(ciliary-derived nerve growth factor CNTF).這兩種細(xì)胞既相似又不同,為我們研究神經(jīng)再生提供了一個新的思路,兩者進(jìn)行比較可能發(fā)現(xiàn)有利于中樞神經(jīng)再生的某些分子.本研究以O(shè)ECs和SCs為實驗對象,采用免疫溶解法獲得兩種細(xì)胞的純培養(yǎng),應(yīng)用免疫細(xì)胞化學(xué)(ICC)和電鏡技術(shù)觀察OECs的抗原表達(dá)以及形態(tài)特征.

4、利用抑制消減雜交技術(shù)(SSH)篩選兩者的差異表達(dá)基因,從兩者的差異表達(dá)基因中分析與中樞神經(jīng)再生相關(guān)的基因表達(dá),為進(jìn)一步闡述中樞神經(jīng)再生機(jī)制創(chuàng)造條件.主要結(jié)果如下:1.免疫溶解法獲得OECs和SCs的純培養(yǎng)免疫溶解法純化2h可見懸浮細(xì)胞增多,純化后24h倒置顯微鏡下觀察成纖維細(xì)胞少見,P75NGFr免疫組化顯示OECs純度可達(dá)95﹪以上;繼續(xù)培養(yǎng)6d后再次進(jìn)行純化可去除大部分新增殖的成纖維細(xì)胞,保持OECs純度在95﹪以上.2.ICC技術(shù)

5、研究OECs的抗原表達(dá),電鏡技術(shù)觀察OECs的超微結(jié)構(gòu)特征OECs免疫組化結(jié)果顯示:P75LNGFr(+),GFAP(+),NCAM(+),CDK5(-). 免疫細(xì)胞化學(xué)特征為:P75LNGFr染色均勻分布于整個細(xì)胞和突起,核區(qū)較為淺淡;GFAP染色較深分布于整個胞漿和突起;NCAM免疫陽性細(xì)胞表面均有分布.SEM顯示OECs核不規(guī)則,呈分葉狀或齒狀,核仁明顯,染色質(zhì)均勻分布于核中,異染色質(zhì)可在核膜下形成塊狀結(jié)構(gòu).3.SSH技術(shù)篩選OE

6、Cs和SCs的差異表達(dá)基因測序結(jié)果得到了4個不同的已知基因,分別編碼:肝白血病因子(hepatic leukemia factor Hlf),糖基化磷脂酰肌醇磷脂酶D1(Glycosylphosphatidylinositol phospholipase D1 GPLD1),Phr1(PAM)和縫隙連接蛋白亞單位connexin43.在4個已知基因中,phr1和hlf與突觸形成相關(guān);縫隙連接蛋白亞單位connexin43參與細(xì)胞間的信號