雪旺細(xì)胞與異種骨支架的體外復(fù)合培養(yǎng)研究.pdf

1、隨著組織工程骨研究的深入,用于較小骨缺損治療的顆粒工程骨技術(shù)已基本達(dá)到臨床治療要求;但針對(duì)大段骨缺損治療的工程骨技術(shù),與臨床應(yīng)用尚有較大距離。從仿生學(xué)角度重建工程骨的神經(jīng)支配及血液供應(yīng),將有望克服目前工程骨骨修復(fù)效果欠佳,力學(xué)性能較差等缺陷;既往研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)組織存在于骨組織中且參與骨代謝的調(diào)節(jié),動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也表明當(dāng)骨支配神經(jīng)遭到破壞后,支配區(qū)域骨組織密度明顯下降,生物力學(xué)性能也嚴(yán)重受損[1],故此我們認(rèn)為骨神經(jīng)化可能是改善組織工程骨修復(fù)效果

2、的關(guān)鍵問題。雪旺細(xì)胞作為外周神經(jīng)髓鞘細(xì)胞,廣泛應(yīng)用于中樞、周圍神經(jīng)損傷的重建研究,其通過機(jī)械性引導(dǎo),分泌神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)、促突起生長(zhǎng)因子(NPF)、軸突誘導(dǎo)因子,促進(jìn)髓鞘化等方式引導(dǎo)神經(jīng)軸突再生[2-3],故此本實(shí)驗(yàn)以雪旺神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)、支架材料鑒定、細(xì)胞材料復(fù)合培養(yǎng)為主要研究?jī)?nèi)容,首次探索雪旺細(xì)胞在三維骨支架上的生物學(xué)特性,為骨神經(jīng)化的研究開辟道路。我們選擇在神經(jīng)再生研究中應(yīng)用廣泛的大鼠雪旺氏細(xì)胞(Schwann’s cells:

3、SCs),臨床常用的人同種異體骨作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象;從大鼠雪旺細(xì)胞(SCs)原代培養(yǎng)方法改進(jìn),人同種異體骨支架的制備觀察、毒性檢測(cè),及SCs在三維骨支架上的生長(zhǎng)特性三個(gè)方向設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn);目的為改進(jìn)原代SCs培養(yǎng)技術(shù),參照二維培養(yǎng)模式,觀察三維培養(yǎng)模式下骨支架空隙結(jié)構(gòu)、材料理化特性等對(duì)SCs生長(zhǎng)狀況的影響。
　　一、雪旺細(xì)胞(SCs)原代培養(yǎng)方法的改進(jìn)及驗(yàn)證
　　既往文獻(xiàn)報(bào)道SCs培養(yǎng)主要障礙是:細(xì)胞增殖慢、易凋亡、生長(zhǎng)周期短,易被成纖

4、維細(xì)胞污染;針對(duì)以上問題我們從培養(yǎng)基成分、取材及培養(yǎng)步驟、純化方法等方面進(jìn)行了技術(shù)創(chuàng)新,以提高SCs增殖速度及純度。方法:配置新型培養(yǎng)液,綜合應(yīng)用谷氨酰胺(Gsn)、牛垂體提取物(BPE)、腺苷酸環(huán)化酶激活物(forskolin)等雪旺促生長(zhǎng)因子;取P2代細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)組用新型培養(yǎng)液,對(duì)照組采用普通培養(yǎng)液培養(yǎng)1-8天,行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察、MTT法細(xì)胞增殖檢測(cè);取P0代采用多次、雙向差速法,阿糖胞苷分段抑制法等改進(jìn)純化方法,對(duì)SCs進(jìn)行處理,傳

5、至P1代行S-100+DAPI免疫熒光染色,激光共聚焦檢測(cè),分析圖片計(jì)算純度,與既往經(jīng)典培養(yǎng)方法文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果對(duì)比。結(jié)果:相差、共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示 SCs形態(tài)良好、增殖正常;細(xì)胞增殖檢測(cè):第1-3d兩組細(xì)胞光吸收值比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),第4-8d實(shí)驗(yàn)組光吸收值高于對(duì)照組,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);P1代SCs純度為95.89±3.45％,高于既往文獻(xiàn)95%的純度報(bào)道,且純度隨代數(shù)的增加而提高。結(jié)論:

6、新型促增殖培養(yǎng)液可促進(jìn)SCs增值,純化方法提高了SCs純度,新培養(yǎng)方法可為骨神經(jīng)化的研究提供優(yōu)質(zhì)的SCs細(xì)胞。
　　二、異種骨支架材料的制備與檢測(cè)
　　目的:制備異種骨支架材料即人同種異體骨,支架材料形態(tài)學(xué)觀察,檢測(cè)材料孔徑、孔隙率及細(xì)胞毒性;方法:支架材料制備、儲(chǔ)存由西京醫(yī)院綜合骨庫完成;體式解剖顯微鏡支架形態(tài)學(xué)檢測(cè);液體替代法檢測(cè)材料孔隙率;掃描電鏡圖片檢測(cè)分析材料孔徑范圍;提取材料浸提液細(xì)胞毒性檢測(cè),實(shí)驗(yàn)組:細(xì)胞培養(yǎng)液

7、添加材料浸提液,對(duì)照組:不添加浸提液,細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測(cè)兩組細(xì)胞增值規(guī)律;結(jié)果:材料孔隙率(porisity)為78.26±2.95%,孔徑:300-1000μm,支架材料具有良好的三維孔隙結(jié)構(gòu);兩組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線趨勢(shì)一致,絕大多數(shù)時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞數(shù)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)結(jié)論:材料成分對(duì)細(xì)胞增殖無明顯毒性反應(yīng),人同種異體骨支架的空間結(jié)構(gòu)、理化性能有利于骨神經(jīng)化的進(jìn)行。
　　三、二維平面、三維立體雪旺細(xì)胞(SCs)培養(yǎng)模型的建立與研

8、究
　　目的:研究三維立體結(jié)構(gòu)對(duì)SCs增殖的影響,驗(yàn)證骨支架材料與SCs的生物相容性,總結(jié)神經(jīng)細(xì)胞與骨支架復(fù)合培養(yǎng)的規(guī)律。方法:制備鼠尾膠原;實(shí)驗(yàn)分組:三維培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)組(SCs+骨支架材料),二維培養(yǎng)對(duì)照組(SCs+膠原玻片);細(xì)胞增殖檢測(cè):培養(yǎng)1-8d,計(jì)數(shù)法檢測(cè)兩組細(xì)胞增殖規(guī)律并繪制生長(zhǎng)曲線;SEM檢測(cè):復(fù)合培養(yǎng)后3d、7d兩組取樣掃描電鏡檢測(cè)。結(jié)果:兩組細(xì)胞生長(zhǎng)曲線整體變化趨勢(shì)相近,主要時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞數(shù)差異經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意

9、義(P>0.05);SEM檢測(cè):兩組細(xì)胞均可正常粘附生長(zhǎng),無明顯細(xì)胞固縮或崩解現(xiàn)象,細(xì)胞梭形形態(tài)、串珠及肩并肩特征性排布方式,較之前相差顯微鏡、免疫熒光檢測(cè)結(jié)果未見明顯改變,圖片分析可見第3d,實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞胞體長(zhǎng)度(50-100μm)明顯長(zhǎng)于對(duì)照組(40-50μm),第7d,兩組細(xì)胞長(zhǎng)度相似(50-100μm),實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞表現(xiàn)出明顯孔內(nèi)遷移趨勢(shì)。結(jié)論:支架材料與SCs的生物相容性和鼠尾膠原相仿,均良好;二維、三維狀態(tài)下細(xì)胞增殖速率無明顯差