自體軟骨細(xì)胞復(fù)合Ⅰ型膠原支架體外動態(tài)培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、【目的】目前，自體軟骨細(xì)胞移植術(shù)（ACI）是治療大面積關(guān)節(jié)軟骨缺損的首選方法。ACI技術(shù)現(xiàn)已發(fā)展到第三代技術(shù)，也稱為基質(zhì)誘導(dǎo)的自體軟骨細(xì)胞移植技術(shù)（MACI）。然而，MACI技術(shù)仍難以生成理想的透明軟骨修復(fù)軟骨缺損區(qū)，并且修復(fù)效果不穩(wěn)定。因此，如何對MACI技術(shù)中軟骨細(xì)胞的體外擴(kuò)增，支架材料，細(xì)胞復(fù)合支架材料的共培養(yǎng)等條件優(yōu)化改進(jìn)，成為解決這一問題的關(guān)鍵，這也是目前軟骨組織工程研究的熱點(diǎn)。本研究通過比較體外靜態(tài)與動態(tài)培養(yǎng)兩種方式對培養(yǎng)人

2、關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞復(fù)合Ⅰ型膠原支架材料的效果，從而探索體外構(gòu)建MACI手術(shù)中修復(fù)關(guān)節(jié)軟骨缺損區(qū)移植物的適宜條件及方式。
　　【方法】取人關(guān)節(jié)軟骨組織，體外分離消化成軟骨細(xì)胞，單層培養(yǎng)擴(kuò)增至P2代，免疫熒光表型鑒定。將P2代軟骨細(xì)胞接種于Ⅰ型膠原支架上，隨機(jī)分為三組，A組采用靜態(tài)培養(yǎng)，B組于微重力生物反應(yīng)器中動態(tài)培養(yǎng)，C組繼續(xù)采用單層培養(yǎng)。體外培養(yǎng)7d后，采用倒置相差顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)；熒光顯微鏡、SEM、HE染色觀察細(xì)胞在支架上的分布、

3、黏附、生長及形態(tài)特點(diǎn)；實(shí)時熒光定量PCR檢測軟骨細(xì)胞表型特異基因(COL-2)的表達(dá)情況，并進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。
　　【結(jié)果】體外分離培養(yǎng)的 P2代軟骨細(xì)胞倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)呈多角形為主，Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)陽性，提示 P2代細(xì)胞表型維持良好；熒光顯微鏡觀察：與 A組比較，支架內(nèi)B組細(xì)胞數(shù)量較多且分布均勻；SEM觀察示：空白支架多孔結(jié)構(gòu)，A組軟骨細(xì)胞在支架表面分布較少，黏附于支架表面，B組軟骨細(xì)胞在支架表面大量生長，融合成片，形態(tài)規(guī)則

4、；HE染色結(jié)果：空白支架橫斷面內(nèi)部明顯多層孔隙結(jié)構(gòu)，A、B組樣本大體結(jié)構(gòu)及內(nèi)部孔隙結(jié)構(gòu)均保持完整，孔隙內(nèi)均可見細(xì)胞黏附，B組孔隙內(nèi)細(xì)胞數(shù)量及細(xì)胞外基質(zhì)優(yōu)于 A組；RT-PCR檢測：A、B組軟骨細(xì)胞 COL-II基因表達(dá)水平較單層培養(yǎng)組明顯增加，A、B組之間 COL-II基因表達(dá)水平無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　【結(jié)論】軟骨細(xì)胞與Ⅰ型膠原支架復(fù)合后，與靜態(tài)培養(yǎng)相比，體外動態(tài)培養(yǎng)可明顯促進(jìn)細(xì)胞增殖及細(xì)胞外基質(zhì)分泌；與單層培養(yǎng)相比，動態(tài)及靜態(tài)培養(yǎng)