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文檔簡介
1、第一章、一種改進的大鼠胎肝干細胞分離純化方法
背景:干細胞是一種具有自我更新能力和多向分化潛能的細胞,存在于許多組織中;根據(jù)其發(fā)育階段不同分為胚胎干細胞和成體干細胞。肝干細胞(hepatic stemcell,HSC)是成體干細胞的一種,可分化為成熟肝細胞、膽管上皮細胞和胰腺上皮細胞。跟據(jù)其起源的不同,可分為肝源性肝干細胞和非肝源性肝干細胞,前者主要包括肝卵圓細胞、小肝細胞,后者主要起源于骨髓干細胞和胚胎干細胞。目前研究肝
2、干細胞已成為世界范圍的熱點,由于它具有來源廣泛、增殖能力強、移植細胞體積小等傳統(tǒng)肝細胞無可比擬的優(yōu)點,可以預測它將替代肝臟移植和肝細胞移植成為治療器官衰竭的一種重要細胞來源。正是由于肝干細胞治療各種原因引起的肝病具有無可比擬的優(yōu)勢,因此探討如何獲得高純度的肝干細胞及其特異性的標志物有重要的現(xiàn)實意義。
正常情況下,體內肝干細胞多處于靜息期,數(shù)量極少,分離時常先經(jīng)藥物或手術造成肝臟損傷,肝臟灌流或聯(lián)合細胞分離液分離來獲得肝干細
3、胞,操作復雜且成本較高。相比較傳統(tǒng)的肝干細胞分離培養(yǎng)方法而言,本實驗室首次采用先機械剪碎酶消化法分離獲得肝干細胞,簡單的離心分離法和胰蛋白酶選擇性消化法相結合,從孕15天大鼠胎肝組織中成功分離出肝干細胞。此方法在原代即可獲得形態(tài)均一、增殖速度快、性狀穩(wěn)定的LSCs,且具有操作簡單、快捷、實用、對細胞損傷小等優(yōu)點,為其作為組織工程種子細胞提供了實驗基礎。
目的:
改進大鼠胎肝干細胞的分離純化方法,提高肝臟干細胞
4、分離的純度和活力。
方法:
1、購清潔級別近交系孕15天SD大鼠,利用械剪碎酶消化法分離獲得肝干細胞,后經(jīng)簡單的離心分離法以及胰蛋白酶選擇性消化法進行進一步的純化,得到較為純化的肝干細胞。加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng),顯微鏡下觀察細胞貼壁情況及形態(tài)學變化。
2、將卵圓細胞接種于預先用0.2%明膠處理的蓋玻片上置于24孔培養(yǎng)板中,37℃,5%CO2孵箱培養(yǎng)24小時,至細胞長成單層后行
5、免疫熒光化學檢測。細胞消化傳代,對P10代細胞進行免疫組織化學檢測。分別檢測P1和P10代肝干細胞表面標志物CD34、C-Kit、OV6、CK19的表達情況。
結果:分離的大鼠胎肝干細胞接種培養(yǎng)瓶24 h后開始貼壁,5d后細胞體積增大,呈梭形或多邊形。經(jīng)1~2次差異性消化傳代后,細胞呈集落樣生長,邊緣清晰且折光率強。免疫細胞化學檢測示:P1代大鼠胎肝干細胞C-Kit、甲胎蛋白(AFP)抗原、OV6、細胞角蛋白(CK)19呈
6、陽性表達,不表達ALB。P10代肝干細胞C-Kit、CK19、OV-6及CD34呈陽性表達。
結論:
此方法在原代即可獲得形態(tài)均一、增殖速度快、性狀穩(wěn)定的LSCs,且具有操作簡單、快捷、實用、對細胞損傷小等優(yōu)點,為深入研究肝干細胞生物學特性和進行體內移植實驗提供了物質基礎。
第二章、大鼠肝損傷后成熟肝細胞和卵圓細胞在肝再生中的作用
背景:長期以來,成熟肝細胞和卵圓細胞在損傷肝的再生
7、中如何發(fā)揮作用一直是肝干細胞研究領域的核心問題,對兩者在損傷肝再生中的作用也有著不同的觀點。一方面,有報道認為部分肝切除(partial hepatectomy,PH)后大鼠肝可在二周內再生并恢復至原來大小,有人連續(xù)進行了12次PH后發(fā)現(xiàn)仍能完成肝再生:這種肝再生多被認為是單獨由成熟肝細胞分裂增殖完成的。另一方面,在損傷肝再生中發(fā)揮了作用的、起源于門管區(qū)小膽管和Hering's管的卵圓細胞(OVC)被認為可能是肝內源性的具有肝膽雙向分化
8、潛能的成體肝干細胞。目前,為研究成體肝臟中肝干細胞的增殖、分化,研究者們采用各種不同的方法抑制肝細胞增殖,并采用藥物(如CC14)或肝部分切除術等誘導肝臟急性損傷,以激活肝臟干細胞。從而研究肝損傷后成熟肝細胞和卵圓細胞與肝臟再生的關系。
本研究鑒于RS是公認的能長期抑制成熟肝細胞分裂增生的肝化學毒劑,而PH又能給予強烈的肝再生需求,我們建立了肝臟切除及其聯(lián)合應用倒千里光堿導致肝臟急性損傷的大鼠模型,通過對Rs/PH和1/3
9、PH后肝再生過程中成熟肝細胞和卵圓細胞的比較病理學研究,并依據(jù)研究中觀察到的一系列現(xiàn)象,探討關于肝損傷后成熟肝細胞和卵圓細胞與肝臟再生的關系。
目的:
聯(lián)合應用倒千里光堿(RS)和肝臟1/3切除術(1/3PH)建立大鼠肝損傷模型。觀察大鼠肝損傷后肝細胞和卵圓細胞增殖情況,探討關于肝損傷后成熟肝細胞和卵圓細胞與肝臟再生的關系。
方法:
1、30只大鼠隨機分為2組,每組15只。倒千里光
10、堿/肝臟1/3切除組(RS/PH組):取150g左右SD大鼠,腹腔注射倒千里光堿溶液30 mg/kg,共注射2次,每次間隔2周。肝臟1/3切除組(1/3PH組):用生理鹽水代替倒千里光堿,腹腔注射30 mg/kg,共注射2次,每次間隔2周,第2次腹腔注射4周后,兩組大鼠行肝臟1/3切除術。
2、分別于術后第3、7、14、20天處死大鼠,10%甲醛固定,石蠟包埋,常規(guī)切片,采用蘇木精-伊紅染色,BrdU注射及BrdU免疫熒光
11、化學檢測,CK19、C-Kit免疫組織化學檢測觀察兩組大鼠術后不同時間點肝臟病理形態(tài)變化、細胞增殖情況和CK19、C-kit免疫組化檢測情況。
結果:RS/PH組大鼠術后20d體質量仍低于術前,肝臟增大明顯小于1/3PH組,HE染色示胞體腫大、胞漿疏松、肝細胞廣泛空泡變性,匯管區(qū)小膽管周圍和肝小葉內可見成簇或散在分布的卵圓細胞增生;1/3PH組術后20d體質量恢復接近術前,肝臟損害較RS/PH組輕,Brdu免疫熒光示成熟肝
12、細胞大量增生,術后14d見肝OVC增生,多出現(xiàn)在肝細胞索中,形態(tài)和免疫組化標記與RS/PH組OVC一致。
結論:
成功構建了倒千里光堿聯(lián)合肝臟1/3切除術的急性肝損傷大鼠模型,實驗可見肝臟中毒及中毒后肝干細胞和成熟肝細胞增殖的現(xiàn)象,證實肝細胞更新與損傷后再生是肝流域中肝內外源肝干細胞及成熟肝細胞共同作用的結果。
第三章、GFP轉基因小鼠胎肝干細胞體外分離培養(yǎng)及脾內移植的初步研究
背
13、景:各種原因引起的急、慢性肝功能衰竭的發(fā)病率和死亡率很高,已成為威脅肝病患者生命的主要原因。目前,原位肝移植(OLT)已被證明是治療各種肝功能失代償期、肝功能衰竭期最有效的治療方法,但因為肝源缺乏、費用昂貴、以及移植后并發(fā)癥多等限制了OLT的廣泛應用。近年來,新的干預性治療不斷出現(xiàn),肝細胞移植已開始應用于一些動物模型和人類臨床實驗,但由于肝細胞來源不充足,人們仍然希望能夠獲得大量更安全的細胞來源。肝干細胞的移植為此開拓了新的途徑,肝干細
14、胞是一種多能干細胞,它具有自我更新、高度增殖及向肝細胞和膽管細胞分化的能力,在體內可以分化為肝細胞和膽管細胞,參與肝臟的發(fā)生發(fā)育及損傷后修復等生理病理過程。若能將其大量擴增后再進行移植,就可能從量上解決細胞來源短缺的問題。
肝干細胞移植相對于肝細胞具有更大的優(yōu)勢:(1)肝干細胞具有更大的增殖能力,植入受體后增殖能力強,較少的移植細胞數(shù)就能達到較好的增殖效果;(2)移植肝內后能分化為肝細胞和膽管上皮細胞,對肝組織結構重建及功
15、能恢復更為有利,更為重要的是,肝細胞增殖需要受肝存在選擇壓力,而肝干細胞在正常肝臟環(huán)境中就能大量增殖,為受體肝臟的再生及肝功能恢復提供機會;(3)肝干細胞分化不成熟,免疫原性更弱,Kubota等研究表明肝母細胞中不表達經(jīng)典的MHC-1分子,在肝干細胞同種異體移植時能引起免疫逃逸。移植失敗現(xiàn)象較肝細胞移植少,對受體影響小;(4)肝干細胞直徑(10-12tm)較肝細胞(20-35μm)小,更容易通過肝竇到達肝臟各葉,使其定植及擴增效率增加。
16、而肝細胞移植濃度較高時部分細胞則不能通過匯管區(qū)小血管。因此肝干細胞可以作為生物型人工肝和肝細胞移植最理想的細胞來源,從而在肝病基因治療中發(fā)揮重要作用,并有望成為取代嚴重肝功能衰竭患者肝移植的替代療法,具有很大的研究前景。
本研究對L-CL2MDP/RS/PH處理的大鼠進行GFP轉基因小鼠胎肝干細胞移植,結果表明本實驗室建立的肝干細胞系能夠成功植入L-CL2MDP/RS/PH大鼠肝臟中,植入的細胞能夠在受體大鼠肝臟中存活,并
17、且出現(xiàn)不同程度的增殖。而在未作預處理的正常大鼠肝臟中未見GFP+肝干細胞。雖然我們并不能明確移植的胎肝干細胞在肝內增殖程度,但從肝臟中GFP陽性的細胞比例比較,L-CL2MDP/RS/PH實驗組比正常對照組具有明顯的優(yōu)勢。說明L-CL2MDP/RS/PH模型能夠提供一個相對較好的肝干細胞植入的環(huán)境。這為研究適用于細胞移植的實驗動物模型提供了一些有價值的信息。今后我們將擴展這一研究成果,努力與臨床實踐相結合,并回答移植研究中尚待解決的排斥
18、免疫學機制問題。
目的:
1、從熒光轉基因小鼠胎肝中獲得穩(wěn)定表達GFP蛋白的肝臟干細胞2、聯(lián)合應用L-CL2MDP/RS/PH,建立適合肝臟干細胞移植的大鼠動物模型,進一步提高肝干細胞的移植效率。
方法:
1、孕15d綠色熒光蛋白(GFP)轉基因小鼠,體重40-60g,SPF級150g左右SD雄性大鼠30只,GFP轉基因小鼠胎肝干細胞的分離、體外培養(yǎng)與傳代及免疫組化鑒定。
19、 2、建立L-CL2MDP/RS/PH動物模型,將分離的胎肝干細胞通過脾臟注射移植到大鼠肝臟,檢測細胞移植后GFP蛋白的表達,以及免疫組化檢測C-Kit、AFP明確移植的肝干細胞在肝臟內是否增殖。
結果:
1、倒置顯微鏡下見分離的肝干細胞大小均勻,呈鵝卵石形態(tài)。接種培養(yǎng)瓶24h細胞開始貼壁并伸展;培養(yǎng)5d后細胞體積增大,呈梭形或多角形,熒光顯微鏡可觀察到細胞發(fā)出綠色熒光。傳代3次后,細胞狀態(tài)良好,在熒光顯
20、微鏡下可見炫目的綠色熒光,免疫組化檢測P3代細胞CD34、AFP呈陽性表達,。
2、HSCs經(jīng)脾臟移植后3d在熒光顯微鏡下觀察兩組大鼠的肝臟冰凍切片,發(fā)現(xiàn)L-CL2MDP/RS/PH組大鼠肝內散在分布GFP陽性細胞,細胞大小為正常肝細胞的1/3-1/2,與周圍細胞相比,呈現(xiàn)高亮度的綠色熒光;而對照組大鼠肝內未見GFP陽性細胞。移植后30d移植大鼠肝臟內仍可見GFP陽性表達,陽性細胞成團聚集、局灶狀分布,細胞形態(tài)與肝細胞相似
21、。
結論:
1、從GFP轉基因小鼠肝臟中成功分離出胎肝干細胞,分離的細胞原代形態(tài)均一、增殖速度快、傳代3次后均可以穩(wěn)定而強烈表達綠色熒光,為進一步研究提供了良好的示蹤工具。
2、成功建立了L-CL2MDP/RS/PH的大鼠模型,植入的細胞能夠在受體大鼠肝臟中存活,并且出現(xiàn)不同程度的增殖。說明L-CL2MDP/RS/PH模型能夠提供一個相對較好的肝干細胞植入的環(huán)境。這為研究適用于細胞移植的實驗動物
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