葛根素涂層支架對再狹窄的防治及其分子機制研究.pdf

1、一、研究背景冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(冠心病)的高死亡率和高致殘率，已成為嚴重危害我國人民健康的主要疾病，因此加強對冠心病的研究，具有極大的必要性和迫切性。支架安置術作為經皮冠狀動脈內球囊擴張成形術(percutaneoustransluminalcoronaryangioplasty，PTCA)后的補充用于臨床，有效降低了PTCA術后再狹窄的發(fā)生率。但支架安置術后支架內再狹窄ISR(in-stentrestenosis，ISR)發(fā)生率

2、仍高達15％～20％。其發(fā)病的病理機制為：支架植入過程可使內皮細胞損傷，受損的內皮細胞可促進附壁血栓的形成，同時釋放各種血管活性物質、生長因子、粘附分子，如單核細胞趨化蛋白-1(monocytechemoattractantprotein-1，MCP-1)，白介素-6(interleukin，IL-6)、粘附分子細胞間粘附分子-1(intercellularadhesionmolecule，ICAM-1)、血管細胞粘附分子-1(vasc

3、ularcelldhensionmolecule，VCAM-1)等。這些細胞因子可促進血管收縮，促進血管平滑肌細胞(vesselsmoothmuslecell，VSMC)由中膜遷移到內膜并增殖，同時啟動一系列血管損傷后修復反應，促進內膜增厚，形成支架內再狹窄。因此，血栓形成、內膜增厚、血管重塑三個時期構成ISR的發(fā)病主要病理過程。 目前臨床應用的藥物涂層支架主要有雷帕霉素涂層支架及紫杉醇涂層支架。紫杉醇通過阻止微管斷裂，造成細胞

4、凋亡而抑制VSMC增殖，從而抑制內膜增殖；但其在血管壁內的長期存在可導致動脈血管壁壞死和動脈瘤形成，阻礙了其在臨床的廣泛應用。雷帕霉素可使細胞分裂受阻于G1期而不能進入S期，抑制VSMC細胞增殖，大大降低了ISR的發(fā)生率，但發(fā)生晚期血栓的幾率較高，可能與其抑制內皮細胞增殖，導致內皮細胞修復時間延長有關。同時，雷帕霉素涂層支架的價格遠遠超出了我國普通大眾的經濟承受能力，因而有必要尋求一種適合我國生活水平且療效較好的藥物涂層支架。

5、葛根素(Puerarin，Pur)為異黃酮類化合物，屬于植物雌激素，現代藥理研究證明，葛根素在心血管中具有多種功能，主要有抗血小板活性，改善纖溶酶活性及減輕炎癥反應的作用；使內皮細胞羥脯氨酸代謝減慢，減少內壁膠原形成，有利于防止血小板粘附、聚集和血栓形成；葛根素注射液可使冠心病心絞痛患者冠脈內NO水平明顯升高，從而減輕內皮細胞的損傷。本課題前期研究證實，葛根素可促進VSMC凋亡，在血管損傷動物實驗中發(fā)現，治療組血管內膜面積顯著低于模型組

6、(P＜0.05)，由此推測葛根素可抑制血管內膜的增厚。 二、研究目的及意義本實驗通過觀察葛根素對VSMC增殖、遷移以及內皮細胞修復的影響，旨在探討葛根素抑制支架內再狹窄的作用機制；通過觀察葛根素涂層支架對兔髂動脈球囊損傷后VSMC增殖和內膜增厚的影響，目的在于為該支架進一步的臨床開發(fā)提供實驗基礎。 三、研究內容本課題擬進行以下三方面的實驗研究：(1)探討葛根素對VSMC增殖與遷移的影響；(2)探討葛根素對血管內皮細胞修復

7、的影響；(3)初步探討葛根素涂層支架對家兔髂動脈球囊拉傷模型再狹窄的影響。 四、研究方法1.培養(yǎng)VSMC，采用MTT法觀察葛根素對由凝血酶誘導的VSMC生長的影響，流式細胞法觀察其對VSMC的細胞周期的影響，確定其對VSMC增殖的影響。在此基礎上探討其對VSMC細胞周期調控蛋白p21Cip1表達的影響；通過由凝血酶誘導的VSMC遷移模型，觀察其對細胞外基質金屬蛋白酶(maxtrixmetalloproteinases，MMPs)

8、MMP-2和MMP-9的影響。2.培養(yǎng)人臍靜脈內皮細胞(Humanumbilicalveinendothelialcell，HUVE)，采用MTT法觀察葛根素對由凝血酶誘導的HUVE生長的影響，流式細胞法觀察其對HUVEC的細胞周期的影響，確定其對HUVE增殖的影響。在此基礎上探討其對由凝血酶誘導的HUVEC分泌的MCP-1、IL-6、ICAM-1、VCAM-1及NO的影響。 3.在這兩個實驗研究的基礎上，將葛根素注射劑原粉，制

9、成藥物涂層支架(上海微創(chuàng)協(xié)作完成)，選擇大耳白兔先行髂動脈球囊拉傷作為模型組，然后行髂動脈支架植入術，用裸支架為對照組，觀察葛根素涂層支架對再狹窄的防治作用。 五、實驗結果1.葛根素可抑制凝血酶誘導的VSMC增殖，在抑制VSMC增殖過程中，經免疫組化染色發(fā)現高濃度組可有增加p21Cip1蛋白表達的趨勢，抑制CDK-2蛋白的趨勢；在抑制VSMC遷移的過程中可抑制MMP-2和MMP-9的表達(與模型組相比P＜0.05)； 2

10、.葛根素可抑制凝血酶誘導的HUVE增殖，抑制細胞因子IL-6、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1、高濃度組可促進HUVE分泌NO(與模型組相比P＜0.05)； 3.動物實驗研究發(fā)現，與球囊拉傷組相比，葛根素涂層支架可顯著改善管腔面積，抑制內膜增殖(P＜0.05)，免疫組化染色發(fā)現其可明顯增加VSMC的p21Cip1蛋白表達，抑制CDK-2蛋白表達，抑制細胞因子IL-6表達的趨勢，有促進VEGF表達的趨勢。 六、結論1

11、.葛根素可能通過增加細胞周期調控p21Cip1蛋白表達，抑制CDK-2蛋白表達，抑制VSMC增殖，在抑制VSMC遷移過程中，抑制VSMC分泌MMP-2和MMP-9的表達。 2.葛根素可抑制HUVE增殖，可能與其抑制細胞因子IL-6、MCP-1、ICAM-1、VCAM-1表達，促進HUVE分泌NO。 3.葛根素涂層支架可改善管腔面積，抑制內膜增殖，這可能與其抑制VSMC增殖有關，推測其抑制VSMC增殖可能又與其增加p21C