基于MDCK的葛根素跨膜轉運機制的研究.pdf

1、MDCK(Madin-Darby Canine Kidney)是馬丁達比犬的腎近區(qū)小管上皮細胞,它和Caco-2是目前應用于體外跨膜轉運研究的兩個最主要的單層細胞模型。和Caco-2一樣,MDCK接種在半透膜上之后能分化成柱狀單層上皮并形成致密的連接。此外，MDCK還具有生長快和細胞亞型少的優(yōu)勢，這使得實驗周期能夠大大縮短并且實驗結果重現性較高。P-gp(P-糖蛋白，P-glycoprotein)廣泛存在于人體各組織細胞中，可能量依賴性

2、的將細胞內藥物泵出到細胞外,導致藥物透膜吸收減少,血藥濃度降低。維拉帕米(verapamil)是P-gp的常用抑制劑。
　　葛根素(Puerarin),又名普樂林,是從中國傳統(tǒng)中藥葛根中提取出的一種異黃酮類化合物,是中藥葛根的主要活性成分。葛根素具有多種而復雜的藥理作用,比如降血壓、降血脂、降血糖、抑制血小板聚集、抗氧化、抗炎、抗心律失常、舒張心腦血管和神經保護作用等。葛根素的藥理作用明確,資源豐富,價格低廉,臨床應用前景廣闊。葛

3、根素的口服利用度比較低,現在對于葛根素的藥劑學研究重點方向是提高其生物利用度。
　　本實驗的目的是建立MDCK單層模型和葛根素的HPLC測定方法,分析了濃度、方向、溫度和P-gp抑制劑維拉帕米(verapamil)對葛根素跨膜轉運過程的影響,對于提高葛根素的口服生物利用度相關研究具有一定的指導意義。具體研究工作如下:
　　第一部分建立葛根素HPLC的測定方法
　　采用HPLC法,Shim-pack ODS色譜柱(4.6

4、 mm×250 mm,5μm),柱溫40℃。流動相A為甲醇,B相為0.2％(v/v)磷酸水溶液(PH用三乙胺調為3.5),以A:B=30:70(v/v)進行液相洗脫,檢測波長250 nm,流速1.0 mL·min-1,進樣20μL。在此條件下,葛根素線性良好(R2>0.9999,n=7),日內精密度≤0.61%,日間精密度≤2.13%。
　　第二部分MDCK細胞模型的建立
　　將MDCK按5×104個細胞/cm2接種在Mil

5、licell-CM Hanging Culture Plate Inserts上培養(yǎng)至細胞生長分化成細胞單層,用Millicell-ERS測量細胞單層的電阻值以確定細胞單層的完整性和致密性。只有電阻值大于140Ω·cm2的細胞單層才可使用。
　　第三部分不同條件下葛根素的跨膜轉運實驗
　　用HEPES濃度為10 mmol·L-1的Hanks溶液作為轉運媒介進行葛根素跨膜轉運實驗。對葛根素濃度、轉運方向、轉運環(huán)境溫度和有無 P

6、-gp的抑制劑分別進行考察。80μg/mL葛根素在37℃和4℃下,A→B方向上的Papp分別是(2.36±0.12)×10-6和(6.10±0.36)×10-7 cm/s,而在 B→A上則分別為(9.24±0.75)×10-7和(2.14±0.25)×10-7 cm/s。37℃下當加入維拉帕米之后80μg/mL葛根素的吸收Papp上升到(5.74±0.28)×10-6 cm/s。結果發(fā)現:葛根素的轉運速率和透過量隨濃度的增加而上升;不同