葛根素調節(jié)支架內狹窄炎癥反應的機制研究.pdf

1、目的與背景： 1987年支架在臨床實踐中的應用是經皮冠狀動脈介入治療(PCI)領域中的一個里程碑，其后的10余年來，冠狀動脈支架植入術成為冠心病(CHD)治療中一種有確切療效的重要手段，但相當高(10％～50％)的支架內再狹窄(ISR)率限制了支架植入術的發(fā)展。隨著可在局部緩慢釋放抑制血管平滑肌細胞增殖藥物的藥物涂層支架(DES)的應用，ISR率明顯降低，大大延緩了支架術后再次行PCI的時間。目前，臨床常用的有雷帕霉素涂層支架和

2、紫杉醇涂層支架。但藥物涂層支架的使用也面臨許多問題。如支架運用的遠期療效，以及昂貴的價格等。因此，有必要尋求一種療效較好，價格合適的藥物涂層支架。從支架洗脫藥物的角度來說，葛根素具有以下優(yōu)勢：(1)為異黃酮，具有脂溶性，能在組織中長期存留；(2)抑制血管平滑肌細胞增殖，促進血管平滑肌細胞凋亡；(3)促進內皮細胞修復；(4)抗炎作用；(5)抑制血小板聚集。以上特點表明，葛根素具有防治支架術后再狹窄的可能性。所以采用中藥葛根素涂層支架進行動

3、物實驗，并與裸支架、PC涂層支架以及臨床應用的國產雷帕霉素涂層支架(Firebird)進行比較，觀察葛根素對家兔髂動脈支架植入術后再狹窄的療效，探討葛根素藥物涂層支架能否有效抑制內膜增生，能否抑制支架內再狹窄的發(fā)生；并進一步通過體外實驗考察葛根素能否有效保護血管內皮細胞，抑制炎癥反應，從而在早期阻斷再狹窄的發(fā)生和發(fā)展，并初步探討其作用機制。 本實驗分為三個部分： 1.葛根素對人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)炎性損傷后修復保

4、護作用研究 方法：(1)HUVEC的分離培養(yǎng)及鑒定；(2)噻唑藍(MTT)比色法測定葛根素對體外培養(yǎng)的白細胞介素-1β(IL-1β)損傷后HUVEC增殖和活性的影響；(3)硝酸還原酶法測定葛根素對IL-1β?lián)p傷后HUVEC分泌一氧化氮(NO)的影響；(4)放免法測定葛根素對IL-1β?lián)p傷后HUVEC分泌內皮素-1(ET-1)影響；結果：高、中、低三劑量組葛根素均能保護內皮細胞，提高HUVEC活性。其中葛根素濃度10<'-3>mo

5、l·L<'-1>時，能明顯提高內皮細胞活性； IL-1β可使細胞培養(yǎng)上清液中NO含量減少，ET-1含量升高，與正常對照組比較有顯著性差異。葛根素高、中、低三劑量組均可使NO含量增加，與模型組比較有顯著性差異。其中，葛根素高、中劑量組可使ET-1含量降低，與模型組比較有顯著性差異。但葛根素低劑量組降低ET-1含量作用不明顯，與模型組比較，無差異性。 2.葛根素對炎性損傷后HUVEC的細胞因子表達及炎性細胞黏附遷移的影響 方

6、法:(1)采用ELISA法檢測內皮細胞培養(yǎng)液上清中的單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)，白細胞介素-6(IL-6)，腫瘤壞死因子-α(TNF-α)，E-選擇素(E-slectin)的含量；(2)采用黏附實驗的方法檢測葛根素對HUVEC和U937單核細胞黏附的影響；(3)采用Transwell法，檢測葛根素對U937單核細胞遷移的影響；(4)采用Westemblot分析葛根素對內皮細胞核轉錄因子NF-кBP65活化以及對P-IкBα的影響

7、。結果：細胞ELISA法觀察到：IL-1β刺激下，HuVEC的粘附分子E-selectin、趨化因子MCP-1、炎癥因子IL-6、TNF-α的表達量增高。葛根素能降低炎性損傷后HUVEC的E-selectin、MCP-1、IL-6、TNF-α表達量；黏附實驗證實，IL-1β刺激下，HUVEC與U937單核細胞的黏附增強，葛根素能抑制HUEVC與L1937單核細胞的黏附；趨化遷移實驗證實，內皮細胞經IL-1β作用后對U937單核細胞趨化作

8、用增強，而加入葛根素后，可減少U937細胞的遷移數目；Westen blot實驗顯示：IL-1β刺激HUVEC，誘導IкBα磷酸化，提高NF-кB活性，葛根素能抑制IкBα磷酸化，阻止內皮細胞NF-кB的活化過程。 3.家兔髂動脈支架植入術觀察葛根素涂層支架的療效 方法：行家兔髂動脈支架植入術，四周后處死，取支架植入處血管切片。前期實驗已經證實，葛根素能抑制家兔髂動脈新生內膜的增生，并且免疫組化也顯示，葛根素能促進內皮細

9、胞內皮細胞生長因子(VEGF)表達增多，降低炎性因子IL-6表達。在此基礎上，本實驗采用免疫組化法進一步觀察組織中NF-кBP65，MCP-1蛋白表達情況。結論：支架內再狹窄的形成機制復雜，炎癥反應作為一個復雜的互相影響的網絡式反應，是支架術后再狹窄發(fā)展過程中的重要因素。 通過以上三部分實驗結果證實： 1. 葛根素對血管內皮細胞的損傷有保護作用，并能調節(jié)內皮細胞活性物質的分泌，保護內皮細胞的功能。 2. 葛根素通