Aβ誘導(dǎo)AD大鼠的炎癥機(jī)制及乙酰葛根素和殼聚糖磷脂酰膽堿的干預(yù)作用.pdf

1、研究背景和意義：
　　阿爾茨海默病(Alzheimer disease，AD)是一種起病隱匿的進(jìn)行性發(fā)展的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，臨床上主要表現(xiàn)為進(jìn)行性記憶減退和認(rèn)知障礙。AD可能是一組異質(zhì)性疾病，病因尚未十分明確，存在多種因素，包括生物因素和社會(huì)心理因素。近年來大量研究證實(shí)，AD腦（尤其在海馬）內(nèi)持續(xù)存在著慢性進(jìn)展性的炎性反應(yīng)，認(rèn)為小膠質(zhì)細(xì)胞活化及炎癥介導(dǎo)的神經(jīng)毒性在神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制中起了決定性作用，炎性反應(yīng)是AD出現(xiàn)認(rèn)

2、知和記憶障礙的重要機(jī)制。其中，有證據(jù)表明，β淀粉樣蛋白(amyloid-beta，Aβ)沉積激活小膠質(zhì)細(xì)胞引起的炎癥反應(yīng)是AD的發(fā)病核心，Aβ誘導(dǎo)引起的神經(jīng)炎癥是AD進(jìn)展的關(guān)鍵事件之一，其中小膠質(zhì)細(xì)胞是主要涉及的細(xì)胞，因此對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞的激活進(jìn)行干預(yù)可能會(huì)減緩疾病的進(jìn)程，從而對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)起保護(hù)作用，因而，以小膠質(zhì)細(xì)胞為靶目標(biāo)的研究有望成為新型抗AD藥物研發(fā)的新方向。另外，目前公認(rèn)的是膽堿能假說，認(rèn)為老年認(rèn)知障礙的臨床癥狀是由于患者腦內(nèi)膽

3、堿酯能神經(jīng)元損傷引起乙酰膽堿生成、釋放減少所致。AD患者乙酰膽堿遞質(zhì)減少，因此，可通過增加乙酰膽堿的含量來治療AD。
　　目前有關(guān)AD抗炎方面藥物的研究主要集中在諸如非類固醇抗炎藥(NSAIDS)、雌激素等，其防治AD的共同通路可能都是通過抑制AD的始動(dòng)環(huán)節(jié)，即抑制患者腦內(nèi)Aβ沉積和老年斑的形成以及由此而引發(fā)的腦內(nèi)炎癥反應(yīng)。但NSAIDs的長(zhǎng)期應(yīng)用可導(dǎo)致嚴(yán)重的胃粘膜損傷和腎功能障礙等，長(zhǎng)期使用雌激素可能誘發(fā)乳腺或子宮內(nèi)膜的癌變;N

4、SAIDs和雌激素的毒副作用，限制了它們?cè)谂R床上的使用。
　　葛根素(Puerarin)是從中藥葛根中提取的異黃酮類化合物，具有阻斷β受體、增加腦血流和腦代謝、清除氧自由基、促進(jìn)免疫、改善學(xué)習(xí)記憶、抑制Aβ激發(fā)的大鼠海馬炎性反應(yīng)等功效，是臨床上治療冠心病、腦血栓的常用和有效藥物，但由于其脂溶性差，血腦屏障透過率低，因此在治療腦部疾病時(shí)不能充分發(fā)揮其藥理活性，很大程度上限制了其臨床療效的發(fā)揮。乙酰葛根素（六乙酰葛根素，化學(xué)名8-C-

5、β-D-2"，3"，4"，6"-四乙酰基吡哺葡萄糖-7，4'-二乙?；慄S酮）是由葛根素經(jīng)用醋酐溶解并?；玫降母鸶匮苌?，在大鼠體內(nèi)代謝為葛根素，口服后在大鼠體內(nèi)的暴露水平得到顯著提高，更容易通過血腦屏障發(fā)揮作用，有更大的臨床應(yīng)用價(jià)值和前景。以往研究顯示乙酰葛根素對(duì)腦缺血再灌注的保護(hù)作用，其機(jī)制可能通過作用于NMDA受體、抗氧自由基、抗脂質(zhì)過氧化、抑制C-fos和ICAM-1、誘導(dǎo)VEGF等。但關(guān)于乙酰葛根素用于AD抗炎作用的研究文

6、獻(xiàn)報(bào)道較少。
　　殼聚糖(Chitosan)是甲殼素脫乙?；漠a(chǎn)物，為天然陽離子聚合物，無毒，安全可靠，呈堿性，且具有很好的生物相容性。國外研究表明，殼聚糖能調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖及細(xì)胞因子的產(chǎn)生，清除自由基，中和體內(nèi)毒素，保護(hù)腦神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞膜。有研究發(fā)現(xiàn)，高分子量水溶性殼聚糖能預(yù)防神經(jīng)細(xì)胞凋亡。Mi-Sun Kim等體外研究顯示水溶性殼聚糖的抗炎作用，可降低并延遲AD病理改變。卵磷脂是生物細(xì)胞膜的主要構(gòu)成成份，且具有抗炎、

7、增強(qiáng)免疫作用，所含膽堿可作為神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的前體物質(zhì)，是神經(jīng)元之間依靠化學(xué)物質(zhì)傳遞信息的一種最主要的“神經(jīng)遞質(zhì)”，一旦與殼聚糖形成復(fù)合物，可作為載體攜帶殼聚糖通過血腦屏障。本課題組前期應(yīng)用溶劑分散法和濕態(tài)研磨法制備殼聚糖磷脂復(fù)合物，并進(jìn)行了其防治老年性癡呆的基礎(chǔ)和臨床研究，從組織形態(tài)學(xué)角度研究發(fā)現(xiàn)殼聚糖磷脂膽堿的抗氧化、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞作用，顯示殼聚糖磷脂膽堿可提高癡呆大鼠和老年性癡呆病人的記憶能力，修復(fù)癡呆大鼠的神經(jīng)細(xì)胞膜損傷，增加腦乙

8、酰膽堿含量，清除自由基，改善腦功能。但殼聚糖磷脂膽堿用于對(duì)AD的抗炎作用及機(jī)制研究，文獻(xiàn)中尚未見報(bào)道。
　　本研究分兩部分:
　　第一部分Aβ誘導(dǎo)AD大鼠的炎癥機(jī)制及乙酰葛根素的干預(yù)作用。
　　目的：
　　本研究采用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，從整體、組織、細(xì)胞、分子水平，利用雙側(cè)海馬注射Aβ1-42所致AD模型大鼠為研究對(duì)象，利用行為學(xué)、免疫組織化學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)方法，觀察乙酰葛根素對(duì)Aβ誘導(dǎo)大鼠學(xué)習(xí)記憶的作用及抗炎機(jī)制，為

9、AD治療提供有效的策略方法和理論依據(jù)。
　　方法：
　　采用雙側(cè)海馬注射Aβ1-42法所致AD模型大鼠為研究對(duì)象。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:將40只wistar大鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組、Aβ模型組、乙酰葛根素低劑量組和高劑量組，每組各10只。術(shù)后14天，藥物低劑量組和高劑量組分別腹腔注射給予乙酰葛根素100mg/kg和200mg/kg，共12天。對(duì)照組和模型組給予腹腔注射相同容量生理鹽水，共12天。應(yīng)用Morris水迷宮試驗(yàn)觀察乙酰葛根素

10、對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，包括觀察記錄大鼠的逃逸時(shí)間及在原平臺(tái)象限停留時(shí)間。應(yīng)用免疫組織化學(xué)法、透射電鏡技術(shù)，觀察乙酰葛根素對(duì)Aβ1-42模型大鼠大腦皮層及海馬小膠質(zhì)細(xì)胞的影響。并應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)海馬PKC-δ、IKK-β、iNOS陽性表達(dá)及定位。應(yīng)用Western-blot法檢測(cè)Aβ1-42大鼠海馬PKC-δ、IKK-β及IL-1β的蛋白質(zhì)表達(dá)水平。應(yīng)用ELISA法檢測(cè)大鼠血清中IL-6含量的變化。
　　全

11、部數(shù)據(jù)分析均采用SPSS17.0軟件進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析及t檢驗(yàn)，P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.Aβ1-42誘導(dǎo)對(duì)大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響及乙酰葛根素的作用。
　　Morris水迷宮定位航行實(shí)驗(yàn)顯示，模型制備前，4組大鼠到達(dá)平臺(tái)的逃避潛伏期大致相同（P＞0.05）;術(shù)后14天，模型組、藥物低劑量組、高劑量組大鼠到達(dá)平臺(tái)的潛伏期明顯長(zhǎng)于空白對(duì)照組(P＜0.01);術(shù)后

12、26天，即乙酰葛根素治療12天后，空白組、藥物低劑量、高劑量組大鼠到達(dá)平臺(tái)的潛伏期明顯短于模型組（乙酰葛根素低劑量組，P＜0.05;乙酰葛根素高劑量組，P＜0.01）?？臻g探索實(shí)驗(yàn)顯示:模型制備前，4組大鼠在原平臺(tái)象限停留時(shí)間大致相同（P＞0.05）;術(shù)后14天，模型組、藥物低劑量組、高劑量組大鼠在原平臺(tái)象限停留時(shí)間減少，明顯少于空白對(duì)照組(P＜0.01);乙酰葛根素治療12天后，空白對(duì)照組、藥物低劑量組、高劑量組大鼠在原平臺(tái)象限停留時(shí)

13、間明顯高于模型組(乙酰葛根素低劑量組，P＜0.05;乙酰葛根素高劑量組，P＜0.01)。
　　2.Aβ1-42誘導(dǎo)對(duì)大鼠大腦皮層及海馬小膠質(zhì)細(xì)胞的影響及乙酰葛根素的作用
　　大腦皮層Iba1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果:模型組小膠質(zhì)細(xì)胞(Microglia，MG)數(shù)目最多，胞體增大增粗，黃染，著色深;乙酰葛根素低劑量組、高劑量組MG數(shù)目較少，胞體變小，淡染，著色淺;對(duì)照組MG數(shù)目最少，淡染。Iba1陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果顯示，模型組與對(duì)照

14、組比較，MG數(shù)目明顯增多（P＜0.05），而乙酰葛根素低劑量組和高劑量組與模型組比較，前額皮層小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目明顯減少(乙酰葛根素低劑量組，P＜0.05;乙酰葛根素高劑量組，P＜0.01)。
　　透射電鏡結(jié)果顯示:對(duì)照組MG較小，可見清晰的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體，核仁清楚，異染色質(zhì)明顯，電子密度高。模型組MG有較多突起，異染色質(zhì)減少和松散，胞漿豐富，核糖體數(shù)量增加，并可見溶酶體顆粒。乙酰葛根素低劑量組:胞漿電子密度低，可見破碎的線粒體嵴

15、。乙酰葛根素高劑量組:細(xì)胞核形狀規(guī)則，可見高爾基復(fù)合體。
　　3.Aβ1-42誘導(dǎo)對(duì)大鼠海馬組織中PKC-δ及IKK-β的影響及乙酰葛根素的作用
　　PKC-δ、IKK-β被選為本研究與NF-κB通路相關(guān)的指標(biāo)。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了每組大鼠海馬組織PKC-δ和IKK-β的免疫染色反應(yīng)。PKC-δ染色結(jié)果:其免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)呈棕黃色，定位于胞膜和胞漿。AD模型組PKC-δ的免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞最多，著色最深，細(xì)胞內(nèi)的陽性顆粒最多，

16、主要位于胞漿內(nèi);對(duì)照組和藥物組陽性細(xì)胞較少，神經(jīng)元胞漿著色淺。定量分析結(jié)果顯示:模型PKC-δ海馬陽性細(xì)胞的數(shù)量高于對(duì)照組、乙酰葛根素低劑量組和乙酰葛根素高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），并呈劑量依賴性。
　　在IKK-β免疫反應(yīng)染色也觀察到了類似的結(jié)果:模型組海馬區(qū)IKK-β陽性細(xì)胞最多并成深棕色;對(duì)照組IKK-β陽性細(xì)胞較少，基本沒有棕黃色顆粒表達(dá)的IKK-β，偶見神經(jīng)元胞漿淺著色;乙酰葛根素組可見到少量IKK-β免

17、疫反應(yīng)陽性細(xì)胞且著色淺。定量分析結(jié)果顯示:模型IKK-β海馬陽性細(xì)胞的數(shù)量高于對(duì)照組、乙酰葛根素低劑量組和乙酰葛根素高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，(P＜0.05)，并呈劑量依賴性。
　　Western blot法觀測(cè)了大鼠海馬組織PKC-δ和IKK-β的表達(dá)，結(jié)果顯示:雙側(cè)海馬注射Aβ1-42能顯著增加PKC-δ和IKK-β的表達(dá)，模型組約為正常對(duì)照組的2倍。乙酰葛根素治療能顯著減低Aβ1-42引起PKC-δ和IKK-β的表達(dá)，并呈

18、劑量依賴性。
　　4.Aβ1-42誘導(dǎo)對(duì)大鼠海馬組織中iNOS、IL-1β及血清IL-6的影響及乙酰葛根素的作用
　　iNOS、IL-1β及IL-6被選為本研究炎癥反應(yīng)的標(biāo)志物。免疫組織化學(xué)法檢測(cè)了海馬組織iNOS的表達(dá)。iNOS染色結(jié)果:其免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)呈棕黃色，定位于細(xì)胞的胞膜和胞漿。其中，AD模型組iNOS的免疫反應(yīng)陽性細(xì)胞最多，著色最深，細(xì)胞內(nèi)的陽性顆粒最多，主要位于胞漿內(nèi);對(duì)照組和藥物組陽性細(xì)胞較少，神經(jīng)元胞漿著

19、色淺。定量分析結(jié)果顯示:模型iNOS海馬陽性細(xì)胞的數(shù)量高于對(duì)照組、乙酰葛根素低劑量組和乙酰葛根素高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(乙酰葛根素低劑量組P＜0.05;乙酰葛根素高劑量組P＜0.01)，并呈劑量依賴性。
　　Western blot分析表明，雙側(cè)海馬注射Aβ1-42能顯著增加IL-1β的表達(dá)，模型組約為正常對(duì)照組的2倍。
　　Elisa實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，治療后模型組血清中IL-6的含量顯著高于空白對(duì)照組、乙酰葛根素低劑量組、

20、高劑量組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.Aβ1-42雙側(cè)海馬注射能明顯降低大鼠學(xué)習(xí)記憶能力，成功模擬炎性AD模型，可以用于檢測(cè)藥物的抗炎作用。
　　2.乙酰葛根素對(duì)Aβ1-42所致AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶障礙具有明顯的改善作用;由此推斷出，乙酰葛根素能夠成為防治AD發(fā)生發(fā)展的新型藥物。
　　3.乙酰葛根素的作用機(jī)制可能是抑制了Aβ沉積所引起的小膠質(zhì)細(xì)胞激活，下調(diào)腦組織PKC-δ和IKK-β

21、的表達(dá)，從而抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，減少了炎性因子iNOS、IL-1β、IL-6的分泌，減輕大腦皮層、海馬神經(jīng)元及小膠質(zhì)細(xì)胞的炎性反應(yīng)，從而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。
　　第二部分殼聚糖磷脂酰膽堿對(duì)Aβ誘導(dǎo)AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶作用及抗炎機(jī)制。
　　目的：
　　本研究采用體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，從整體、組織水平，利用雙側(cè)海馬注射Aβ25-35所致AD模型大鼠為研究對(duì)象，應(yīng)用行為學(xué)、免疫組織化學(xué)技術(shù)觀察殼聚糖磷脂酰膽堿對(duì)Aβ誘導(dǎo)大鼠的作用

22、及抗炎機(jī)制，為AD治療提供有效的策略方法。
　　方法：
　　采用噴霧干燥器制備殼聚糖磷脂酰膽堿復(fù)合物微球，用分光光度法分別測(cè)定殼聚糖、卵磷脂的含量。采用雙側(cè)海馬注射Aβ25-35法所致AD模型大鼠為研究對(duì)象。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組:將50只Wistar大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、Aβ模型組、殼聚糖磷脂酰膽堿低劑量組、中劑量組和高劑量組，每組各10只。術(shù)后第7天開始，殼聚糖磷脂酰膽堿低劑量組、中劑量組、高劑量組分別給予0.2/(kg·d)、0.

23、4/（kg·d）和1.0/（kg·d）灌胃，共30天。對(duì)照組和模型組給予相當(dāng)劑量生理鹽水灌胃，共30天。應(yīng)用Morris水迷宮試驗(yàn)，觀察殼聚糖磷脂酰膽堿對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶功能，包括觀察記錄大鼠的逃逸時(shí)間、穿越平臺(tái)次數(shù)及在原平臺(tái)象限停留時(shí)間。應(yīng)用免疫組織化學(xué)技術(shù)，觀察殼聚糖磷脂酰膽堿對(duì)Aβ25-35 AD模型大鼠大腦皮層小膠質(zhì)細(xì)胞的影響，并應(yīng)用免疫組織化學(xué)法檢測(cè)海馬PKC-δ、iNOS及IL-1β的陽性表達(dá)及定位。

24、r>　　全部數(shù)據(jù)分析均采用SPSS17.0軟件進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用方差分析及t檢驗(yàn)，P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.殼聚糖磷脂酰膽堿對(duì)AD模型大鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響AD動(dòng)物模型制備前，各組大鼠學(xué)習(xí)記憶水平比較，差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。造模14d后，模型組和殼聚糖磷脂酰膽堿組大鼠的學(xué)習(xí)記憶水平明顯低于對(duì)照組（P＜0.01）。藥物干預(yù)30d后，各殼聚糖磷脂酰膽堿組及對(duì)照組

25、大鼠平均潛伏期(average escape latency，AEL)明顯縮短，且單位時(shí)間內(nèi)跨越原平臺(tái)次數(shù)及在原平臺(tái)象限停留時(shí)間增加，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。
　　2.Aβ25-35誘導(dǎo)對(duì)大鼠大腦皮層MC的影響及殼聚糖磷脂酰膽堿的作用
　　大腦皮層Iba1免疫組織化學(xué)染色結(jié)果:模型組MG數(shù)目多，胞體增大增粗，黃染，著色深;殼聚糖磷脂酰膽堿低劑量組、中劑量組、高劑量組MG數(shù)目減少，胞體變小，淡染，著色淺;

26、對(duì)照組MG數(shù)目最少，淡染。定量分析結(jié)果顯示:模型組Iba1反應(yīng)強(qiáng)度明顯高于正常組（P＜0.05），殼聚糖磷脂酰膽堿低劑量組、中劑量組、高劑量組陽性表達(dá)依然強(qiáng)于正常組，但明顯弱于模型組(P＜0.05)。
　　3.殼聚糖磷脂酰膽堿對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)Wistar大鼠海馬PKC-δ的影響
　　PKC-δ在大鼠海馬區(qū)的免疫反應(yīng)程度，依次為模型組、殼聚糖磷脂酰膽堿低劑量組、中劑量組、高劑量組、對(duì)照組。PKC-δ免疫反應(yīng)陽性物質(zhì)呈棕黃色

27、，定位于細(xì)胞的胞膜和胞漿。其中，模型組PKC-δ陽性細(xì)胞最多并著色深，細(xì)胞內(nèi)的陽性顆粒最多，主要位于胞漿內(nèi);對(duì)照組PKC-δ陽性細(xì)胞最少，偶見神經(jīng)元胞漿淺著色。定量分析結(jié)果顯示:模型PKC-δ海馬陽性細(xì)胞的數(shù)量高于對(duì)照組、殼聚糖磷脂酰膽堿低劑量組、中劑量組、高劑量組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，并呈劑量依賴性。
　　4.殼聚糖磷脂酰膽堿對(duì)Aβ25-35誘導(dǎo)Wistar大鼠海馬iNOS、IL-1β的影響
　　Aβ模型組i

28、NOS和IL-1β陽性細(xì)胞表達(dá)明顯高于對(duì)照組，殼聚糖磷脂酰膽堿低劑量組、中劑量組、高劑量組。殼聚糖磷脂酰膽堿藥物組和模型組相比，炎性因子iNOS和IL-1β的陽性細(xì)胞數(shù)顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，殼聚糖磷脂酰膽堿藥物組和對(duì)照組相比，陽性細(xì)胞表達(dá)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。提示Aβ25-35誘導(dǎo)可激發(fā)大鼠海馬組織iNOS和IL-1β的表達(dá)，而殼聚糖磷脂酰膽堿可降低iNOS和IL-1β的表達(dá)。
　　結(jié)論：

29、>　　1.以殼聚糖和大豆卵磷脂為原料經(jīng)噴霧干燥法可以合成殼聚糖磷脂酰膽堿復(fù)合物微球。這一方面提高殼聚糖的脂溶性，使殼聚糖更有效地發(fā)揮作用;另一方面可以更好地發(fā)揮卵磷脂供給膽堿及保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞膜的作用。
　　2.殼聚糖磷脂酰膽堿對(duì)Aβ25-35所致AD模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙有明顯的改善作用;
　　3.殼聚糖磷脂酰膽堿可能是通過抑制小膠質(zhì)細(xì)胞增生及激活，進(jìn)而減少細(xì)胞因子iNOS、IL-1β的產(chǎn)生，從而發(fā)揮其神經(jīng)保護(hù)作用。