同型半胱氨酸對(duì)BMSCs分化功能的影響及白藜蘆醇、葛根素的干預(yù)作用.pdf

1、目的：觀(guān)察同型半胱氨酸（Hcy）對(duì)大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSCs）成骨及成脂分化功能的影響，及白藜蘆醇、葛根素干預(yù)后細(xì)胞成骨成脂分化功能的變化，探討同型半胱氨酸致骨質(zhì)疏松及白藜蘆醇及葛根素抗骨質(zhì)疏松的作用機(jī)制。
　　方法：1.全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)大鼠 BMSCs，P3代 BMSCs經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物 CD34、CD44、CD45、CD90的表達(dá)。2.MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性，篩選合適的同型半胱氨酸、白藜蘆醇及葛根素干預(yù)濃

2、度。3.將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的P3代BMSCs分為：正常對(duì)照組、OM或AM組（成骨或成脂誘導(dǎo)）、R或P組（10μmol/L白藜蘆醇或葛根素）、H組（100μmol/L Hcy）、R+H或P+H組（10μmol/L白藜蘆醇或葛根素+100μmol/L Hcy）、R+H+L或P+H+L組（10μmol/L白藜蘆醇或葛根素+100μmol/L Hcy+10μmol/L LY294002）。通過(guò)茜素紅及油紅O染色后鈣結(jié)節(jié)及陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)的變化，實(shí)時(shí)熒光定

3、量 PCR檢測(cè)成骨分化調(diào)控基因Runx2，成骨標(biāo)志基因BMP2、OPG、Collagen?及成脂分化調(diào)控基因PPAR-γ表達(dá)，試劑盒檢測(cè)ALP水平評(píng)估細(xì)胞成骨及成脂分化功能。4.流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS，試劑盒檢測(cè)MDA、SOD、GSH-PX評(píng)估細(xì)胞氧化應(yīng)激水平。5.WB檢測(cè)各組細(xì)胞AKT、p-AKT及FoxO1蛋白表達(dá)變化。
　　結(jié)果：1.SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離培養(yǎng)及鑒定：SD大鼠的股骨及脛骨骨髓中成功分離出梭形的BMSCs，

4、流式細(xì)胞儀檢測(cè)可見(jiàn)P3代大鼠BMSCs表達(dá)CD44（99.86±5.934）％及CD90（95.10±2.013）%，不表達(dá)CD34（0.68±0.612）%及CD45（0.31±0.117）%。2.MTT結(jié)果示：1~1000μmol/L的Hcy對(duì)BMSCs增殖呈濃度依賴(lài)性抑制（p＜0.05），0.1μmol/L的Hcy則促進(jìn)BMSCs增殖（p＜0.05）。0.1~100μmol/L白藜蘆醇可以促進(jìn)BMSCs增殖，以10μmol/L的濃

5、度作用最佳（p＜0.05），10~100μmol/L葛根素可以促進(jìn)BMSCs增殖（p＜0.05），而白藜蘆醇及葛根素均可以減弱Hcy對(duì)BMSCs增殖的抑制作用（p＜0.05）。3.茜素紅、油紅O染色及PCR結(jié)果示：成骨誘導(dǎo)后茜素紅染色可見(jiàn)Hcy干預(yù)后細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)形成明顯減少，Runx2、BMP2、Collagen?及OPG表達(dá)下調(diào)，ALP活性下降（p＜0.05）。PPAR-γ表達(dá)增高（p＜0.05），成脂誘導(dǎo)后油紅O染色可見(jiàn)H組陽(yáng)性細(xì)胞百

6、分比高。與H組比較R+H組及P+H組Runx2、BMP2、Collagen?及OPG表達(dá)增高（p＜0.05），ALP活性升高（p＜0.05），PPAR-γ表達(dá)下降（p＜0.05）。PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑LY294002干預(yù)后，白藜蘆醇及葛根素對(duì)Hcy抑制成骨相關(guān)基因促進(jìn)成脂相關(guān)基因表達(dá)的作用被部分阻斷（p＜0.05）。4.氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果示：Hcy干預(yù)后細(xì)胞氧化應(yīng)激指標(biāo)ROS及MDA增高，抗氧化劑SOD及GSH-PX活性降低

7、（p＜0.05），Gadd45表達(dá)增加（p＜0.05），白藜蘆醇及葛根素可以使Hcy干預(yù)細(xì)胞ROS、MDA水平降低而SOD、GSH-PX水平升高（p＜0.05），Gadd45表達(dá)下降（p＜0.05），但白藜蘆醇及葛根素對(duì)Hcy的干預(yù)作用可以被LY294002部分阻斷（p＜0.05）。5.WB結(jié)果示：成骨誘導(dǎo)分化后細(xì)胞p-AKT/AKT表達(dá)升高（p＜0.05），與正常對(duì)照組比較Hcy干預(yù)可以使p-AKT/AKT及FoxO1表達(dá)減少（p＜0

8、.05），白藜蘆醇及葛根素干預(yù)后可以減弱Hcy對(duì)p-AKT/AKT及FoxO1表達(dá)的抑制，而這種干預(yù)作用可以被LY94002部分阻斷（p＜0.05）。
　　結(jié)論：同型半胱氨酸可以通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞氧化應(yīng)激，進(jìn)一步抑制大鼠 BMSCs成骨分化促進(jìn)其成脂分化。而白藜蘆醇及葛根素具有抗骨質(zhì)疏松的作用，其機(jī)制可能是：白藜蘆醇及葛根素通過(guò)激活PI3K/AKT/FoxO1信號(hào)通路發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，進(jìn)而促進(jìn)大鼠BMSCs成骨分化功能抑制其成脂分化功