糖尿病大鼠心肌損傷的炎性機(jī)制及葛根素的干預(yù)作用研究.pdf

1、研究目的：
　　 糖尿病心肌病(Diabetic cardiomyopathy，DCM)是糖尿病(Diabetes mellitus，DM)主要并發(fā)癥之一。研究提示炎癥因子可能是引起糖尿病心肌損傷的原因之一，因而抑制炎癥因子可能是保護(hù)糖尿病心肌損傷的重要策略之一。本課題旨在研究糖尿病大鼠心肌NF-KB-TNF-α-ICAM-1，COX-2炎癥信號(hào)通路的改變，從整體、組織、細(xì)胞和分子水平深入研究糖尿病心肌損傷的病理生理機(jī)制，同時(shí)研

2、究葛根素對(duì)上述炎癥通路的干預(yù)作用，為糖尿病心血管并發(fā)癥的治療尋找新的治療靶點(diǎn)和新藥開發(fā)目標(biāo)。
　　 研究方法
　　 1．實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠模型的建立
　　 健康雄性SD大鼠50只，隨機(jī)挑選10只作為陰性對(duì)照組，其余40只一次性腹腔注射鏈脲佐菌素( Streptozotocin，STZ)60mg/kg，72h后測(cè)空腹血糖，以血糖值≥16.7mmol/L為糖尿病模型成功。造模成功8周后，檢測(cè)大鼠血清AST、LDH、CK

3、、CK-MB4種心肌酶的含量，并進(jìn)行Masson三色染色判斷有無心肌損傷及纖維化。
　　 2．葛根素對(duì)糖尿病心肌損傷大鼠心功能及高糖損傷心肌細(xì)胞的影響
　　 (1)將糖尿病心肌損傷大鼠隨機(jī)分為模型組、葛根素小劑量組(50mg/kg)和大劑量組(200mg/kg)，每組10只。每天腹腔注射給藥1次，陰性對(duì)照組和模型組給予同體積的生理鹽水，連續(xù)給藥8周。末次給藥后觀察大鼠的一般情況，評(píng)價(jià)各組的體重(Body weight，B

4、W)，空腹血糖(Fasting blood glucose，F(xiàn)BG)，總膽固醇(Total cholesterol，TC)，甘油三酯(Triglyceride，TG)、乳酸脫氫酶( Lactate dehydrogenase，LDH)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)、肌酸激酶( Creatine kinase，CK)、心肌型肌酸激酶同功酶(Isoenzyme of creatinekinase

5、, CK-MB)含量。小動(dòng)物超聲成像系統(tǒng)觀測(cè)左心室舒張末期內(nèi)徑(Leftventricular internal diastolic diameter, LVIDd)、左心室收縮末期內(nèi)徑(Left ventricular intemal diameter at end-systole，LVIDs)、短軸縮短率(Fractional Shortening．FS)及左心室射血分?jǐn)?shù)(Left ventricular ejection frac

6、tion，LVEF)的改變。用Biopec生理機(jī)能系統(tǒng)記錄左心室內(nèi)壓變化速率(±dp/dtmax)。血流動(dòng)力學(xué)測(cè)定后，腹主動(dòng)脈取血，分離血清-20℃保存，待用。處死大鼠，迅速開胸取心臟、游離左心室稱重，計(jì)算左心室質(zhì)量指數(shù)(Left ventricular weight index，LVWI，LVW/BW)，取左心室前壁心肌組織固定，透射電鏡觀察其超微結(jié)構(gòu)改變。
　　 (2)取對(duì)數(shù)生長期心肌細(xì)胞分為:正常對(duì)照組:培養(yǎng)基中不加任何刺

7、激物，培養(yǎng)24小時(shí)；高糖損傷模型組:培養(yǎng)基中加入終濃度為33mmol/L的高濃度葡萄糖刺激心肌細(xì)胞，培養(yǎng)24小時(shí)；葛根素處理組:分別加入終濃度為10。4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L的葛根素預(yù)處理12小時(shí)后加入終濃度為33mmol/L的葡萄糖培養(yǎng)12小時(shí)。應(yīng)用瑞氏，吉姆薩染色觀察心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化。
　　 3．葛根素對(duì)糖尿病大鼠心肌及高糖損傷心肌細(xì)胞NF-KB信號(hào)通路的影響
　　 (1)NF-kB:應(yīng)

8、用免疫細(xì)胞熒光化學(xué)檢測(cè)葛根素對(duì)高糖損傷心肌細(xì)胞NF-KB表達(dá)的影響。
　　 (2)TNF-α:應(yīng)用ELISA法檢測(cè)葛根素對(duì)DM大鼠血清中TNF-α表達(dá)的影響。
　　 (3)ICAM-I:應(yīng)用免疫組織熒光化學(xué)檢測(cè)葛根素對(duì)DM大鼠心肌組織ICAM-1表達(dá)的影響；用ICAM-1/FITC標(biāo)記心肌細(xì)胞，流式細(xì)胞儀檢測(cè)葛根素對(duì)心肌細(xì)胞ICAM-I表達(dá)變化的影響，激發(fā)波長488nm，發(fā)射波長535nm，用Cell Quest軟件進(jìn)行

9、統(tǒng)計(jì)分析。
　　 (4)COX-2:應(yīng)用ELISA法檢測(cè)葛根素對(duì)DM大鼠血清、心肌組織勻漿、高糖損傷心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清及心肌細(xì)胞內(nèi)COX-2含量的影響；并用免疫細(xì)胞化學(xué)法觀察葛根素對(duì)高糖損傷心肌細(xì)胞COX-2表達(dá)的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1．糖尿病大鼠模型的建立
　　 與陰性對(duì)照組比較，8周末模型組大鼠血清中AST、LDH、CK、CK-MB4種心肌酶含量均顯著升高(P＜0.01)，Masson_色染色顯

10、示模型組冠狀動(dòng)脈管壁膠原纖維增多呈深藍(lán)色。冠脈周圍纖維組織增生，呈藍(lán)色云霧狀。提示DM大鼠出現(xiàn)心肌損傷并伴有輕度纖維化。
　　 2．葛根素對(duì)糖尿病心肌損傷大鼠心功能及高糖損傷心肌細(xì)胞的影響
　　 (1)實(shí)驗(yàn)期間，陰性對(duì)照組大鼠一般狀態(tài)良好、健壯、皮毛有光澤，對(duì)外界反應(yīng)靈敏。與陰性對(duì)照組比較，模型組大鼠逐漸出現(xiàn)多飲、多食和消瘦，精神萎靡，皮毛無光澤，尿量多、腥臊酮臭味加重、稀便；部分大鼠尾、足部出現(xiàn)皮膚破損、白內(nèi)障等。與模

11、型組比較，葛根素各劑量組(50mg/kg、200mg/kg)也出現(xiàn)消瘦、多飲多尿、腥臊酮臭味加重等，但癥狀比模型組明顯減輕。
　　 (2)與模型組相比，①葛根素大劑量組(200mg/kg)體重明顯升高(P＜0.01)，F(xiàn)BG，TC，TG及AST、LDH、CK、CK-MB均顯著下降(P＜0.01)；②葛根素大劑量組(200mg/kg) LVID值及LVIDs值明顯下降(P＜0.01)，F(xiàn)S值及LVEF值明顯升高(P＜0.01，P＜

12、0.05)；③葛根素大劑量組(200mg/kg)+dp/dtmax明顯升高(P＜0.01)，葛根素小劑量組(50mg/kg)無顯著性差異(P＞0.05)。葛根素處理組(50mg/kg.200mg/kg)均對(duì)-dp/dtmax明顯降低(P＜0.01)。④葛根素大、小劑量組(50mg/kg、200mg/kg)左心室質(zhì)量指數(shù)減小，尤以葛根素大劑量組(200mg/kg)減小最為明顯(P＜0.01)。
　　 (3)電鏡下觀察顯示:陰性對(duì)照

13、組心肌纖維結(jié)構(gòu)完整，肌小節(jié)排列整齊，線粒體膜完整，細(xì)胞核染色質(zhì)分布均勻，橫紋清晰。模型組肌小節(jié)排列紊亂，線粒體腫脹，增多，呈堆積狀。心肌細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)邊集，呈鋸齒狀。葛根素處理組(50mg/kg、200mg/kg)病變較模型組明顯減輕，細(xì)胞排列整齊，線粒體排列較規(guī)則，大小較一致，肌原纖維斷裂現(xiàn)象輕。
　　 (4)瑞氏．吉姆薩染色結(jié)果顯示:與高糖損傷心肌細(xì)胞模型組比較，葛根素處理組(10.4mol/L、10-5mol/L、10

14、-6mol/L)心肌細(xì)胞損傷明顯減輕，細(xì)胞形態(tài)飽滿，核膜完整，核漿比例正常。
　　 3．葛根素對(duì)糖尿病大鼠心肌及高糖損傷心肌細(xì)胞NF-KB信號(hào)通路的影響
　　 (1)免疫細(xì)胞熒光化學(xué)檢測(cè)結(jié)果顯示:模型組心肌細(xì)胞胞質(zhì)中NF-KB紅色熒光稍減弱，胞核中紅色熒光著色強(qiáng)，葛根素處理組(10.4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L)可見胞質(zhì)中的紅色熒光較模型組強(qiáng)，正常對(duì)照組弱，胞核中紅色熒光著色較模型組弱，較正常對(duì)照

15、組強(qiáng)。
　　 (2)與模型組相比，葛根素大劑量組(200mg/kg)血清TNF-α水平明顯降低(P＜0.01)。
　　 (3)免疫組織熒光化學(xué)檢測(cè)ICAM-1結(jié)果顯示:與陰性對(duì)照組比較，模型組和葛根素處理組(50mg/kg.200mg/kg)心肌組織ICAM-I亮綠色熒光明顯增強(qiáng)，與模型組比較，葛根素處理組(50mg/kg、200mg/kg)隨藥物劑量的增加胞漿亮綠色熒光明顯減弱；流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示:正常對(duì)照組心肌細(xì)

16、胞ICAM-1陽性率僅為3.15％，與正常對(duì)照組比較，模型組心肌細(xì)胞ICAM-I陽性率明顯升高為14.81％;與模型組比較，葛根素處理組(10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L)心肌細(xì)胞ICAM-1陽性率明顯降低分別為8.24％、12.97％、11.14％。
　　 (4)與模型組相比，①葛根素大劑量組(200mg/kg)血清COX-2水平顯著降低(P＜0.01)，小劑量組(50mg/kg)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0

17、.05)。②葛根素大、小劑量組(200mg/kg.50mg/kg)心肌組織勻漿中COX-2明顯降低(P＜0O1)。與高糖損傷心肌細(xì)胞模型組比較，①葛根素各濃度組(10-4mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L)心肌細(xì)胞培養(yǎng)上清液中COX-2明顯降低，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。②葛根素高濃度組(1×10-4 mol/L)和低濃度組(1×10-6 mol/L)心肌細(xì)胞內(nèi)COX-2水平顯著降低(P＜0.01)，中濃度組(1×

18、10-5mol/L)心肌細(xì)胞內(nèi)COX-2水平雖有所降低但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。
　　 (5)免疫細(xì)胞化學(xué)法顯示:與高糖損傷心肌細(xì)胞模型組比較，葛根素處理組(104mol/L、10-5mol/L、10-6mol/L) COX-2的表達(dá)隨藥物濃度的增加胞漿棕黃色顆粒明顯減少，以高濃度組(1×10-4mol/L)、中濃度組(1×10-5mol/L)最為明顯，低濃度組(1×10-6mol/L)變化不大。
　　 結(jié)論：

19、r>　　 1．STZ糖尿病大鼠成模8周后，出現(xiàn)心肌損傷且伴有輕度纖維化。
　　 2．葛根素對(duì)糖尿病引起的大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)損傷及伴有的心臟收縮和舒張功能障礙有一定的改善作用。
　　 3．使用葛根素預(yù)處理可以減輕高濃度（33mmol/L）葡萄糖引起的心肌細(xì)胞損傷，提示其具有保護(hù)心肌細(xì)胞的作用。
　　 4．與陰性對(duì)照組比較，糖尿病心肌組織及高糖誘導(dǎo)心肌細(xì)胞中NF-KB、TNF-α、ICAM-1、COX-2的表達(dá)均明顯