力竭性運(yùn)動(dòng)致延遲性心肌損傷的炎性機(jī)制及苦苣提取物的干預(yù)作用.pdf

1、目的：
　　 近年來(lái)，隨著競(jìng)技體育的飛速發(fā)展和全民健身運(yùn)動(dòng)的廣泛開(kāi)展以及生活壓力增大，鍛煉人數(shù)越來(lái)越多，運(yùn)動(dòng)量日益加大，運(yùn)動(dòng)性猝死事件不斷發(fā)生，其死因85％以上是心源性猝死，且相當(dāng)一部分猝死出現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)結(jié)束之后。為此，長(zhǎng)時(shí)間劇烈運(yùn)動(dòng)或過(guò)度運(yùn)動(dòng)對(duì)心臟產(chǎn)生不良影響的嚴(yán)重醫(yī)學(xué)問(wèn)題以及全民應(yīng)該如何更為健康地運(yùn)動(dòng)成為人們?nèi)找骊P(guān)注的焦點(diǎn)。本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，擬觀察經(jīng)一周反復(fù)力竭性運(yùn)動(dòng)結(jié)束后恢復(fù)期不同時(shí)間點(diǎn)（運(yùn)動(dòng)后即刻、3h、6h、12h

2、、24h、48h和96h）大鼠心肌超微結(jié)構(gòu)改變以及大鼠血清和心肌組織中TNF-α、NF-κB、ICAM-1等炎性因子和細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律;同時(shí)研究苦苣提取物3.2g/kg（按生藥計(jì)）和1.6g/kg對(duì)大鼠力竭性游泳運(yùn)動(dòng)后24h和48h心肌組織病理學(xué)改變以及血清和心肌組織中TNF-α、NF-κB、ICAM-1等炎性因子和細(xì)胞凋亡的影響，以探討運(yùn)動(dòng)延遲性心肌損傷的炎性產(chǎn)生機(jī)制和苦苣提取物的干預(yù)作用，為預(yù)防運(yùn)動(dòng)性猝死的發(fā)生和運(yùn)動(dòng)性心肌損傷

3、的康復(fù)治療提供重要的實(shí)驗(yàn)理論依據(jù)。
　　 方法：
　　 1.運(yùn)動(dòng)延遲性心肌損傷模型的建立采用經(jīng)典的Thomas的方法通過(guò)反復(fù)力竭性游泳運(yùn)動(dòng)建立延遲性心肌損傷實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。力竭性游泳運(yùn)動(dòng)采用尾部負(fù)重2％體重的負(fù)荷，每天游泳至力竭狀態(tài)，連續(xù)1周（7天）。力竭標(biāo)準(zhǔn)采用“經(jīng)過(guò)10秒后動(dòng)物仍不能返回水面為標(biāo)準(zhǔn)”[1]。
　　 2.動(dòng)物分組及給藥將262只健康雄性SD大鼠隨機(jī)分為安靜對(duì)照組(SC，35只)、力竭性運(yùn)動(dòng)模型組（

4、M，155只）和苦苣提取物治療組（D，72只）。安靜對(duì)照組大鼠不進(jìn)行任何運(yùn)動(dòng)直接取材;模型組大鼠進(jìn)行通過(guò)反復(fù)力竭性游泳運(yùn)動(dòng)。運(yùn)動(dòng)模型組根據(jù)運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)時(shí)間不同又分為運(yùn)動(dòng)后即刻組(st)、3h組、6h組、12h組、24h組、48h組和96h組（每組分別為20、17、17、17、17、35、35、17只），運(yùn)動(dòng)結(jié)束后按不同時(shí)間點(diǎn)取材;苦苣提取物3.2g/kg和1.6g/kg給藥組又各自分為給藥24h組和48h組（每組18只）?？嘬奶崛∥锝o藥2

5、4h組分別于運(yùn)動(dòng)后即刻和運(yùn)動(dòng)后23h給藥一次，末次給藥后1h取材;給藥48h組分別于運(yùn)動(dòng)后即刻、24h、47h給藥1次，于末次給藥后1h取材。
　　 3.取材及觀察指標(biāo)①各組大鼠分別于運(yùn)動(dòng)結(jié)束后相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)觀察大鼠身體的一般狀況并稱體重(Body weight，BW)，計(jì)算體重變化百分率。
　　 ②各組大鼠分別自頸靜脈竇取血2ml，制備血清，-20℃保存?zhèn)溆?，采用酶?lián)免疫吸附試驗(yàn)（Enzyme linked immunos

6、orbent assay，ELISA）法檢測(cè)大鼠血清中TNF-α、NF-κ B和ICAM-1含量以及cTnI含量，全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清中心肌酶譜CK、CK-MB含量。
　　 ③處死動(dòng)物，迅速取出心臟并稱重，計(jì)算心臟系數(shù)。
　　 ④心臟用4℃冷生理鹽水清洗后，切取左心室部分肌組織約100mg，制備10％心肌組織勻漿，離心取上清液，-20℃保存?zhèn)溆?，采用ELISA法檢測(cè)大鼠心肌組織中的NF-κB、TNF-α、ICAM-1

7、含量。
　　 ⑤安靜對(duì)照組和模型組每組各取2只大鼠心肌組織做電鏡，觀察心肌組織超微結(jié)構(gòu)改變。
　　 ⑥每組各取5只大鼠剩余心肌放入福爾馬林中固定三天后，取左心室心肌組織，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片，備用，經(jīng)木精-伊紅染色(Hematoxylin-eosinstaining，HE stain)觀察心肌組織病理學(xué)改變;免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)心肌組織中NF-κB、TNF-α、ICAM-1蛋白表達(dá)水平和細(xì)胞凋亡。
　　 ⑦各

8、組另取5只大鼠心肌組織兩塊各約100mg，用液氮迅速制備心肌冰凍標(biāo)本，-70℃保存?zhèn)溆茫捎妹庖哂≯E(Western blotting)檢測(cè)心肌組織中NF-κB、TNF-α、ICAM-1蛋白表達(dá)水平;實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(Real-timefluorescent quantitative PCR，qRT-PCR)檢測(cè)心肌組織中TNF-αmRNA、NF-κ BmRNA和ICAM-1mRNA基因表達(dá)水平。
　　 ⑧采用心臟灌流酶

9、消化法制備分離心肌細(xì)胞，經(jīng)Hoechst33325染色觀察苦苣提取物對(duì)大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響。
　　 結(jié)果：
　　 1.大鼠一般狀況、體重及心臟系數(shù)
　　 (1)與安靜對(duì)照組比較，力竭性運(yùn)動(dòng)模型組大鼠游泳結(jié)束后普遍會(huì)出現(xiàn)呼吸急促、嗜睡，部分大鼠出現(xiàn)腹瀉癥狀，游泳到第5～7天，狀態(tài)明顯下降，游泳時(shí)間縮短，皮毛光潔度差，對(duì)外界的反應(yīng)遲緩，豎毛、皮毛脫落等?？嘬奶崛∥?.2g/kg可以明顯改善上述狀況。
　　

10、(2)與安靜對(duì)照組比較，反復(fù)力竭性運(yùn)動(dòng)模型組各組大鼠體重均具有不同程度的明顯減輕(P＜0.05和P＜0.01)，其中以運(yùn)動(dòng)后24h和96h組體重減輕最大(P＜0.01);苦苣提取物3.2g/kg、1.6g/kg給藥24h組和48h組大鼠體重均有明顯增加。
　　 (3)與安靜對(duì)照組比較，反復(fù)力竭性運(yùn)動(dòng)后即刻、6h、48h組大鼠的心臟系數(shù)均有顯著增加(P＜0.05和P＜0.01);苦苣提取物3.2g/kg、1.6g/kg給藥后48h

11、組與運(yùn)動(dòng)后48h組比較心臟系數(shù)均明顯降低，具有顯著性差異(P＜0.05)。
　　 2.苦苣提取物對(duì)大鼠血清中心肌酶譜CK和CK-MB的影響與安靜對(duì)照組比較，反復(fù)力竭性運(yùn)動(dòng)后24 h和48h組大鼠血清CK和CK-MB活性皆有明顯增加(P＜0.05和P＜0.01)，苦苣提取物小劑量給藥24h組大鼠血清CK和CK-MB活性均有所降低，但無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);苦苣提取物3.2g/kg給藥24h組和48h組以及1.6g/kg給

12、藥48h組大鼠血清CK和CK-MB活性均明顯降低(P＜0.05和P＜0.01)。
　　 3.力竭性運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)和形態(tài)學(xué)改變及苦苣提取物的干預(yù)作用
　　 (1)電鏡下觀察到安靜對(duì)照組大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)正常。反復(fù)力竭性運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相大鼠心肌組織超微結(jié)構(gòu)均有不同程度的損傷;其中以運(yùn)動(dòng)后48h為最嚴(yán)重。
　　 (2)光學(xué)顯微鏡下觀察到安靜對(duì)照組大鼠心肌組織結(jié)構(gòu)正常。力竭性運(yùn)動(dòng)后24h組和48h組大

13、鼠心肌組織均出現(xiàn)局部肌細(xì)胞排列不規(guī)則，橫紋不清晰，核增大，散在點(diǎn)灶狀炎癥壞死等病理改變外，48h多數(shù)肌細(xì)胞發(fā)生溶解性壞死。苦苣提取物3.2g/kg給藥24h組以及苦苣提取物3.2g/kg和1.6g/kg給藥48h組大鼠心肌組織均有所改善。
　　 4.力竭性運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相大鼠血清中TNF-α、 NF-κB和ICAM-1含量的動(dòng)態(tài)變化及苦苣提取物的干預(yù)作用——ELISA法
　　 (1)與安靜對(duì)照組比較，反復(fù)力竭性運(yùn)動(dòng)后24h

14、和48h組血清中TNF-α濃度顯著升高(P＜0.05)，其余各組均有升高趨勢(shì)，TNF-α濃度高峰出現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)后24h;運(yùn)動(dòng)后即刻、3h和6h組大鼠血清中NF-κB濃度均明顯降低(P＜0.01和P＜0.05)，而運(yùn)動(dòng)后12h、24h、48h和96h組NF-κB濃度均顯著升高(P＜0.01)，24h達(dá)高峰，呈現(xiàn)先低后高走勢(shì);運(yùn)動(dòng)后12h、24h、48h和96h組大鼠血清中ICAM-1濃度均明顯增加(P＜0.01和P＜0.05)，運(yùn)動(dòng)后即刻～6

15、h血清中ICAM-1無(wú)明顯變化(P＞0.05)，峰值出現(xiàn)在運(yùn)動(dòng)后96h。
　　 (2)與力竭性運(yùn)動(dòng)后24h組比較，苦苣提取物3.2g/kg給藥24h組大鼠血清中TNF-α、NF-κB和ICAM-1濃度均顯著降低(P＜0.05)，苦苣提取物1.6g/kg使大鼠血清NF-κB濃度顯著降低(P＜0.05);與運(yùn)動(dòng)后48h組比較，苦苣提取物3.2g/kg給藥48h組均使大鼠血清中TNF-α、NF-κB和ICAM-1濃度顯著降低(P＜0.

16、05和P＜0.01)，苦苣提取物1.6g/kg均使血清TNF-α、NF-κB濃度顯著降低(P＜0.05)。
　　 5.力竭性運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相大鼠心肌組織中TNF-α、 NF-κB和ICAM-1含量的動(dòng)態(tài)變化及苦苣提取物的干預(yù)作用——ELISA法
　　 (1)與安靜對(duì)照組比較，反復(fù)力竭性運(yùn)動(dòng)后3h、24h和48h組大鼠心肌組織中TNF-α含量均顯著升高(P＜0.05)，運(yùn)動(dòng)后即刻、6h、12h和96h有升高趨勢(shì)，3h和48h

17、分別達(dá)高峰，呈雙峰變化;力竭性運(yùn)動(dòng)后3h、6h、12h、24h、48h和96h組大鼠心肌組織中NF-κκB含量均明顯升高（P＜0.05和P＜0.01），3h和48h分別達(dá)高峰，呈雙峰變化;運(yùn)動(dòng)后即刻、3h、6h、12h和24h組大鼠心肌組織中ICAM-1含量均顯著升高(P＜0.05)，3h達(dá)高峰，隨后逐漸降低。
　　 (2)與力竭性運(yùn)動(dòng)后24h組比較，苦苣提取物3.2g/kg給藥24h組大鼠心肌組織中TNF-α、NF-κB和IC

18、AM-1濃度均顯著降低(P＜0.05)，苦苣提取物1.6g/kg使大鼠心肌組織NF-κB濃度顯著降低(P＜0.05);與運(yùn)動(dòng)后48h組比較，苦苣提取物3.2g/kg給藥48h組均使大鼠心肌組織中TNF-α和NF-κB顯著降低(P＜0.05)，苦苣提取物1.6g/kg均使心肌組織中TNF-α、NF-κB濃度顯著降低(P＜0.05)。
　　 6.力竭性運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相大鼠心肌組織中TNF-α、 NF-κB和ICAM-1蛋白的表達(dá)及苦苣

19、提取物的干預(yù)作用——免疫組織化學(xué)法
　　 (1)與安靜對(duì)照組比較，力竭性運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相大鼠心肌組織中TNF-α、NF-κ B和ICAM-1蛋白表達(dá)均有增多，其中運(yùn)動(dòng)后48h TNF-α蛋白表達(dá)最多，運(yùn)動(dòng)后3h NF-κ B蛋白表達(dá)最多，運(yùn)動(dòng)后即刻ICAM-1蛋白表達(dá)最多。
　　 (2)與力竭性運(yùn)動(dòng)后24h組比較，苦苣提取物3.2g/kg給藥24h組大鼠心肌組織中TNF-α蛋白表達(dá)有所減少，NF-κB和ICAM-1蛋白表達(dá)

20、顯著減少;與運(yùn)動(dòng)后48h組比較，苦苣提取物3.2g/kg給藥48h組大鼠心肌組織中TNF-α、NF-κB和ICAM-1蛋白表達(dá)均明顯減輕，苦苣提取物1.6g/kg使NF-κB和ICAM-1蛋白表達(dá)均明顯減輕。
　　 7.力竭性運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相大鼠心肌組織中NF-κB、TNF-α和ICAM-1蛋白表達(dá)及苦苣提取物的干預(yù)作用—Western-blotting法
　　 (1)Western-blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與安靜對(duì)

21、照組比較，力竭性運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相大鼠心肌組織中TNF-α、NF-κB和ICAM-1蛋白表達(dá)均顯著升高，其中TNF-α蛋白表達(dá)以運(yùn)動(dòng)后48h組為最高，NF-κB表達(dá)以運(yùn)動(dòng)后即刻、12h和48h分別達(dá)高峰，ICAM-1蛋白表達(dá)以運(yùn)動(dòng)后24h達(dá)高峰。
　　 (2)與力竭性運(yùn)動(dòng)后24h組比較，苦苣提取物3.2g/kg和1.6g/kg給藥24h組均使大鼠心肌組織中TNF-α、NF-κκB和ICAM-1蛋白表達(dá)有所減少;與力竭性運(yùn)動(dòng)后48h組

22、比較，苦苣提取物3.2g/kg給藥48h組大鼠心肌組織中TNF-α和NF-κB蛋白表達(dá)降低更為明顯。
　　 8.力竭性運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相心肌組織中TNF-αmRNA、NF-κBmRNA和ICAM-1mRNA的表達(dá)及苦苣提取物的干預(yù)作用——qRT-PCR法
　　 (1)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與安靜對(duì)照組比較，反復(fù)力竭性運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相大鼠心肌組織中TNF-α mRNA、NF-κB mRNA和ICAM-1mRNA水平均顯著升

23、高(P＜0.05和P＜0.01)，其中運(yùn)動(dòng)后48h達(dá)高峰。
　　 (2)與力竭性運(yùn)動(dòng)后24h組比較，苦苣提取物3.2g/kg給藥24h組使大鼠心肌組織中TNF-α mRNA、NF-κB mRNA和ICAM-1 mRNA表達(dá)水平均顯著降低，苦苣提取物1.6g/kg使TNF-α mRNA明顯降低，NF-κB mRNA和ICAM-1mRNA表達(dá)水平有所下降。與力竭性運(yùn)動(dòng)后48h組比較，苦苣提取物3.2g/kg給藥48h組大鼠心肌組織中

24、TNF-α mRNA、NF-κB mRNA和ICAM-1 mRNA表達(dá)水平明顯下降(P＜0.05和P＜0.01)。
　　 9.力竭性運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相大鼠心肌細(xì)胞凋亡的動(dòng)態(tài)變化及苦苣提取物的干預(yù)作用——TUNEL法和Hoechst33325染色法
　　 (1)TUNEL法結(jié)果顯示，安靜對(duì)照組大鼠心肌組織存在少數(shù)散在的細(xì)胞凋亡;反復(fù)力竭性運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相大鼠心肌組織均出現(xiàn)大量細(xì)胞凋亡，心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)均明顯增加(P＜0.01)，

25、48h達(dá)高峰，且具有一定的時(shí)間依賴性特點(diǎn)。
　　 (2)Hoechst33325染色實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，安靜對(duì)照組大鼠灌流后的懸浮心肌細(xì)胞核多較完整，反復(fù)力竭性運(yùn)動(dòng)后24h和48h組均觀察到大量的核斷裂、濃染、固縮、核質(zhì)不均勻等細(xì)胞凋亡的形態(tài);與運(yùn)動(dòng)后24h和48h組相比，苦苣提取物3.2g/kg和1.6g/kg均明顯改善細(xì)胞凋亡狀態(tài)，凋亡細(xì)胞數(shù)目均有減少，3.2g/kg作用更為明顯。
　　 結(jié)論
　　 1.1周反復(fù)力

26、竭性運(yùn)動(dòng)可以成功地建立延遲性心肌損傷模型。
　　 2.大鼠心肌酶譜和心肌組織結(jié)構(gòu)改變均證實(shí)，反復(fù)力竭性運(yùn)動(dòng)可以引起運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)期不同時(shí)間點(diǎn)大鼠心肌組織不同程度的損傷。苦苣提取物3.2g/kg和1.6g/kg可以改善力竭性運(yùn)動(dòng)誘發(fā)的心肌超微結(jié)構(gòu)損傷和形態(tài)學(xué)改變。
　　 3.ELISA法、免疫組化法以及Western-blotting法均證實(shí)，反復(fù)力竭性運(yùn)動(dòng)可以引起運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)期不同時(shí)間點(diǎn)大鼠血清和心肌組織中TNF-α、NF-κ

27、 B和ICAM-1蛋白表達(dá)不同程度的升高，苦苣提取物3.2g/kg和1.6g/kg可以降低TNF-α、NF-κ B和ICAM-1蛋白表達(dá)水平。
　　 4.qRT-PCR法證實(shí)，反復(fù)力竭性運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相心肌組織中TNF-α mRNA、NF-κ BmRNA和ICAM-1mRNA表達(dá)均有不同程度的升高，苦苣提取物3.2g/kg和1.6g/kg可以明顯降低TNF-α mRNA、NF-κ BmRNA和ICAM-1mRNA表達(dá)水平。

28、　　 5.TUNEL法和Hoechst33325染色法均證實(shí)，反復(fù)力竭性運(yùn)動(dòng)后不同時(shí)相大鼠心肌組織均出現(xiàn)大量細(xì)胞凋亡，苦苣提取物3.2g/kg和1.6g/kg均明顯減少心肌細(xì)胞凋亡。
　　 6.不同方法進(jìn)一步證實(shí)了炎癥介質(zhì)NF-κB、TNF-α、ICAM-1和心肌細(xì)胞凋亡在力竭性運(yùn)動(dòng)誘發(fā)延遲性心肌損傷的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用。
　　 7.苦苣提取物對(duì)力竭性運(yùn)動(dòng)所致的延遲性心肌損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與降低心肌組織中