雷公藤甲素對糖尿病大鼠心肌炎癥損傷的干預(yù)作用及機制.pdf

1、目的:鑒于炎癥反應(yīng)在糖尿病心肌病發(fā)生發(fā)展中的重要作用及雷公藤甲素的抗炎效應(yīng)，我們從理論上推測雷公藤甲素對糖尿病心肌病變具有保護作用。本研究通過建立高糖條件下培養(yǎng)的H9c2心肌細胞株及鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病大鼠模型，探討高糖刺激下心肌炎癥損傷的特征，觀察雷公藤甲素干預(yù)是否對糖尿病心肌病變具有保護作用，并闡明雷公藤甲素抗炎作用的分子生物學(xué)機制，以期為糖尿病心肌病的防治提供一個新的思路和理論依據(jù)。
　　方法:
　　1.細胞實驗:將

2、傳代后培養(yǎng)的處于對數(shù)生長期的H9c2心肌細胞隨機分為3組，每組6孔，每組給予不同處理因素干預(yù)48小時。
　　(1)正常對照組:5.5 mmol/l D-葡萄糖;
　　(2)高葡萄糖組:33mmol/l D-葡萄糖;
　　(3)高葡萄糖+雷公藤甲素組:33mmol/lD-葡萄糖+20ng/ml雷公藤甲素。
　　倒置相差顯微鏡下觀察各組H9c2心肌細胞形態(tài)，MTT法檢測細胞活力，RT-PCR和Western blot

3、分別檢測TNF-α、NF-κ B p65在mRNA和蛋白水平的表達，TransAMTM NF-κ B p65 ELISA測定NF-κ B p65的活性。
　　2.動物實驗:8周齡雄性Sprague-Dawley大鼠一次性腹腔注射70mg/kg鏈脲佐菌素誘導(dǎo)糖尿病模型，正常對照大鼠按體重注射等量檸檬酸鹽緩沖液。建模成功后隨機分為6組，每組入選10只大鼠，每組給予不同處理因素持續(xù)灌胃干預(yù)6周。
　　(1)正常對照組:1 ml/d

4、ay生理鹽水;
　　(2)正常對照+雷公藤甲素組:400μg/kg/day雷公藤甲素;
　　(3)糖尿病組:1 ml/day生理鹽水;
　　(4)糖尿病+低劑量雷公藤甲素組:100μg/kg/day雷公藤甲素;
　　(5)糖尿病+中等劑量雷公藤甲素組:200μg/kg/day雷公藤甲素;
　　(6)糖尿病+高劑量雷公藤甲素組:400μg/kg/day雷公藤甲素。
　　干預(yù)結(jié)束后，所有大鼠先行心臟超聲檢

5、查評價左心室功能，再主動脈采血行生化檢測以評估雷公藤甲素干預(yù)的安全性，并留取心臟組織，HE染色分析各組大鼠心肌組織的病理學(xué)改變;天狼星紅染色評價心肌總膠原蛋白含量的變化;免疫組化法觀察左室心?、瘛ⅱ笮湍z原的沉積，以及炎癥細胞的浸潤（巨噬細胞/CD68+細胞，T淋巴細胞/CD3+細胞）;RT-PCR和Western blot分別檢測心肌TNF-α、IL-1β、ICAM-1、VCAM-1、NF-κ B p65在mRNA和蛋白水平表達;Tra

6、nsAMTM NF-κ B p65 ELISA測定心肌NF-κ B p65的活性。
　　結(jié)果:
　　1.細胞實驗:
　　(1)與正常對照組比較，高糖處理后H9c2心肌細胞NF-κB信號通路被激活，NF-κ B p65亞單位活性及表達上調(diào)，并引起其下游炎癥因子TNF-α表達上調(diào)，細胞活力降低;
　　(2)雷公藤甲素的干預(yù)可抑制高糖環(huán)境下H9c2心肌細胞過度激活的NF-κB信號通路，減輕炎癥反應(yīng)，提高細胞活力。

7、>　　2.動物實驗:
　　(1)與正常對照組比較，糖尿病大鼠血糖升高、體重減輕、全心重/體重比值增加，雷公藤甲素治療對上述指標(biāo)無影響;
　　(2)與正常對照組比較，糖尿病大鼠左心室擴大、收縮幅度降低，心功能(LVEF、FS)減退，雷公藤甲素治療可改善糖尿病大鼠左心功能;
　　(3)與正常對照組比較，糖尿病大鼠心肌纖維化明顯，總膠原含量和Ⅰ、Ⅲ型膠原含量均增加，雷公藤甲素治療后糖尿病大鼠心肌纖維化程度減輕;
　　(

8、4)與正常對照組比較，糖尿病大鼠心肌組織出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為心肌NF-κ B信號通路被激活，引起NF-κ B p65亞單位活性和表達上調(diào)，并啟動其下游基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致包括促炎因子（TNF-α、IL-1β）、細胞間黏附因子(ICAM-1、VCAM-1)在內(nèi)的一系列炎癥因子的過度表達，多種炎癥細胞（巨噬細胞、T淋巴細胞）被募集到心肌組織，雷公藤甲素可抑制過度激活的NF-κB信號通路，顯著減輕糖尿病大鼠心肌組織的炎癥反應(yīng);
　　(

9、5)雷公藤甲素(100μg/kg/day～400μg/kg/day)對大鼠肝臟、腎臟、心臟等重要器官無明顯毒副作用，但高劑量下（400μg/kg/day）存在一定的免疫抑制效應(yīng)，表現(xiàn)為雷公藤甲素干預(yù)的正常大鼠NF-κB活性及其下游炎癥因子的表達降至低于正常對照大鼠水平。
　　結(jié)論:
　　1.結(jié)合體內(nèi)外實驗的結(jié)果，NF-κB信號通路在高糖所致的心肌炎癥損傷中發(fā)揮了重要作用，參與了糖尿病心肌病的發(fā)生、發(fā)展。
　　2.雷公藤