葛根素通過細胞凋亡途徑干預帕金森病模型的研究.pdf

1、安徽醫(yī)科大學博士學位論文葛根素通過細胞凋亡途徑干預帕金森病模型的研究姓名：程月發(fā)申請學位級別：博士專業(yè)：藥理學指導教師：陳志武;李慶林20090401安徽醫(yī)科大學博士學位論文 4 細胞的凋亡過程中的作用；通過給予 6 - O H D A 單側(cè)注射損毀黑質(zhì)神經(jīng)元建立 P D 大鼠模型，研究葛根素對 P D 模型大鼠的影響，進一步探討葛根素的作用機制。 2方法 2 . 1臺盼藍染色法檢測細胞存活率和形態(tài)學觀察 葛根素預處理后培養(yǎng)的 S H

2、- S Y 5 Y 細胞和 1 m MM P P + 作用 4 8h 后臺盼藍檢測。后續(xù)實驗中分組如下：空白對照組、模型組（1 m MM P P + 組）和不同濃度的葛根素藥物組（1 2 . 5μMp u e r a r i n + 1 m MM P P + 組，2 5μMp u e r a r i n + 1 m MM P P + 組，5 0μMp u e r a r i n + 1 m MM P P + 組）。 2 . 2J C -

3、 1 流式細胞檢測線粒體膜電位 葛根素造模 2 4 h 后進行 J C - 1 染色，流式細胞儀分析。 2 . 3E L I S A 檢測胞漿細胞色素 C 的含量 各組細胞培養(yǎng) 24 小時，達到密度為 2x106 cells/ml。ELISA試劑盒檢測細胞色素 C 的含量，Bradford 法檢測蛋白的濃度。 2 . 4W e s t e r nb l o t t i n g 檢測 C y tc 蛋白的表達 細胞造模 2 4 小時后進

4、行胞漿蛋白的提取和定量，S D S 垂直電泳，獲得凝膠；含樣品的凝膠進行電轉(zhuǎn)移后開展免疫學實驗，免疫學：封閉 P V D F 膜 lh后，加入 C y tc 單克隆抗體，常規(guī)加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔 I g G ( 二抗) ， E C L 檢測試劑與膜作用暗室中曝光，X 線顯影、定影。凝膠成像系統(tǒng)進行分析。 2 . 5流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率 各組細胞造模 4 8h 后，按照試劑盒說明書，進行染色，流式細胞儀檢測細胞周期和細胞的

5、凋亡率。 2 . 6C a s p a s e - 3 ，C a s p a s e - 8 ，C a s p a s e - 9 酶活性的檢測 按試劑盒說明完成。各組細胞造模 24 小時后，細胞密度為 2x106 cells/ml 。離心收集細胞后冰浴裂解。設(shè)置反應(yīng)體系，加入 Ac-DEVD - pNA(2mM)后 37℃孵育60- 120 分鐘。顏色變化比較明顯時即可測定 A405。蛋白濃度測定 Bradford 法檢測。Ca