RhoC、RhoGDIα在肺癌細胞系中的表達及與侵襲能力的關系.pdf

1、目的：Rho家族蛋白是Ras超家族中小分子量G蛋白的成員，RhoC是Rho亞族蛋白之一，通過其下游靶分子促進肌動蛋白微絲骨架的聚合，對細胞運動及腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移發(fā)揮重要作用，關于RhoC與肺癌關系尚不清楚。RhoGDI為RhoC的調(diào)節(jié)因子，曾認為其抑制Rho蛋白的活性。近年來的研究顯示RhoGDI對Rho蛋白還可能有激活作用，其在腫瘤的侵襲及進展中亦可能發(fā)揮雙重作用。有研究結(jié)果顯示RhoGDIβ在不同類型腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮兩種相反的作

2、用，而RhoGDIα與腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的關系尚無報道。本實驗中，我們通過檢測不同侵襲能力肺癌細胞的RhoC、PdaoGDIα的mRNA及蛋白表達水平，初步探討RhoC、RhoGDIα與肺癌轉(zhuǎn)移的關系。 材料與方法: 1、材料與試劑 人肺癌細胞系BE1，LH7，A549，A2均由北京醫(yī)學院惠贈，人支氣管上皮細胞HBE購自中南大學湘雅中心實驗室，兔抗人RhoC、羊抗人RhoGDIα多克隆抗體購自Santa Cruz生物

3、技術公司，Trizol總RNA提取試劑購白天根(Tiangen)公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR試劑盒購自大連寶生物(TaKaRa)公司。 2、實驗方法 (1)Westemblot：采用考馬斯亮藍法進行蛋白定量。SDS--聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)印(恒壓50V，2h)，一抗4℃孵育過夜，辣根過氧化物酶標記二抗37~C孵育2h，DAB顯色。經(jīng)凝膠成像系統(tǒng)采集，灰度值測定。 (2)RT-PCR：TRNzol試劑提取細胞總RN

4、A后，逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，均按說明書操作。PCR擴增產(chǎn)物使用1.5％瓊脂糖，120V電泳30min，溴化乙啶(EB)染色，凝膠成像系統(tǒng)下觀察。 (3)Transwell小室體外侵襲實驗：微孔濾膜上平鋪Matrigel膠，小室下室加含血清的培養(yǎng)液，上室加細胞懸液，常規(guī)培養(yǎng)12h，70％L甲醇固定45min，蘇木素染色10min，高倍鏡下計數(shù)膜背面上的穿膜細胞。 (4)免疫熒光：細胞爬片，Triton-100打孔，一抗4℃過