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文檔簡介
1、乙型肝炎病毒感染(Hepatitis B virus,HBV)呈全球范圍廣泛流行,在我國尤為嚴(yán)重。HBV感染可引起急性、慢性和重型肝炎,并與肝硬化、肝癌的發(fā)生密切相關(guān),是嚴(yán)重危害人類健康的感染性疾病。很多流行病學(xué)與實驗證據(jù)表明HBV的感染與原發(fā)性肝細(xì)胞癌(Hepatocellular,HCC)的發(fā)生有很大的相關(guān)性。HBV攜帶者與非HBV攜帶者發(fā)生HCC的比例為200:1。HBV在肝癌的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮的作用是毋庸置疑的,但是其中具體的機制
2、仍然不清楚。
人類HBV屬于嗜肝DNA病毒科,其基因組DNA為部分環(huán)狀雙螺旋結(jié)構(gòu),長約3.2kb?;蚪M中含有四個主要的相互重疊的開放讀碼框(Open reading flame,ORF),分別為S、C、P、X。S-ORF分為S基因、前S2區(qū)和前S1區(qū),各有其起始密碼ATG,C-ORF分為C基因和前C區(qū),各有起始密碼ATG,P-OFR是最長的讀架,其開始區(qū)段與C-ORF重疊,中間與S-ORF重疊,最后區(qū)段與X-ORF重疊,
3、X-ORF在nt1374-1837,adr亞型有27bp的短縮,為其中最小的一種ORF。X蛋白(pX)對轉(zhuǎn)錄有反式激活功能,在HBV介導(dǎo)的致癌作用中作為輔助因子發(fā)揮了重要作用,但具體的致癌機制仍不明確。
目的:為了更好的研究pX的功能及在HCC的發(fā)生發(fā)展中的作用,我們運用基因敲入技術(shù)在人肝癌細(xì)胞株SMMC7721中構(gòu)建穩(wěn)定并且高效表達HBV X基因的細(xì)胞株,穩(wěn)定細(xì)胞株的成功建立也同時為制備、純化pX提供了良好的實驗材料。也
4、為穩(wěn)定細(xì)胞系的構(gòu)建提供了新的方法和視野。
方法:通過電擊轉(zhuǎn)染將基因誘捕載體pU17導(dǎo)入到人類肝癌細(xì)胞系SMMC7721,經(jīng)G418篩選,報告基因X-gal染色后得到X-gal高表達的陽性克??;在這些高表達X-gal的陽性克隆中通過Cre-LoxP置換系統(tǒng),把HBx基因敲入到細(xì)胞的染色體中,再通過基因組PCR、斑點雜交等方法檢測HBx DNA的存在和pX蛋白質(zhì)的表達。
結(jié)果:得到永久性高表達誘捕載體報告基因X-
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