穩(wěn)定高表達(dá)對核苷（酸）類似物耐藥HBV毒株肝癌細(xì)胞系的建立.pdf

1、核苷（酸）類似物治療能快速有效地抑制HBV復(fù)制，延緩肝臟病變的進(jìn)展，從而降低肝硬化和肝癌的發(fā)生率。但長期抗病毒治療容易出現(xiàn)對核苷（酸）類似物耐藥，導(dǎo)致治療失敗。對耐藥機(jī)制的體外研究以及篩選新的針對耐藥HBV毒株的抗病毒藥物需要合適的體外研究模型。為建立穩(wěn)定高表達(dá)耐核苷（酸）類似物HBV變異株肝癌細(xì)胞系，我們開展了以下工作:
　　在研究的第一部分中，我們構(gòu)建了8種HBV表達(dá)質(zhì)粒，包括野生型質(zhì)粒以及常見的7種耐不同核苷（酸）類似物的變

2、異型質(zhì)粒，以用于人肝癌細(xì)胞HepG2和Huh7細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染研究和篩選穩(wěn)定細(xì)胞系。選用野生型質(zhì)粒進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染、潮霉素篩選、陽性克隆篩選、長期傳代以及有限稀釋純化細(xì)胞克隆等步驟，篩選出一株表達(dá)野生型HBV穩(wěn)定細(xì)胞株，建立及完善了篩選穩(wěn)定細(xì)胞系的體系，以應(yīng)用于后續(xù)耐藥HBV穩(wěn)定細(xì)胞系的篩選。
　　在研究的第二部分中，我們應(yīng)用第一部分工作中建立的篩選體系，經(jīng)過大規(guī)模的篩選獲得了一株高表達(dá)耐拉米夫定HBV穩(wěn)定細(xì)胞株，并命名為HepG2-HS

3、204V。采用Southern blot技術(shù)證實(shí)該細(xì)胞株胞內(nèi)HBV復(fù)制水平顯著高于HepG2.2.15細(xì)胞株，上清液中HBsAg和HBeAg病毒蛋白水平顯著高于HepG2.2.15，達(dá)10倍以上。胞外分泌的病毒顆粒水平與HepG2.2.15相似。該細(xì)胞株顯示出預(yù)期的耐藥表型特征，包括對拉米夫定耐藥以及對阿德福韋敏感。采用Southern blot方法證實(shí)該細(xì)胞株內(nèi)HBV基因序列以整合的形式存在;Northernblot的方法證實(shí)2.4/

4、2.1 kb的亞基因組RNA的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于HepG2.2.15，提示可能該細(xì)胞株產(chǎn)生高水平HBsAg的原因。最后我們用CsCl梯度離心分離細(xì)胞上清各組份，采用免疫電鏡以及免疫印跡的方法證實(shí)該細(xì)胞株可以分泌完整的病毒顆粒以及不同形式的亞病毒顆粒。經(jīng)過長期傳代證明了其穩(wěn)定的生物學(xué)特性。在研究的第三部分中，我們同樣應(yīng)用建立的篩選體系，篩選出一株高表達(dá)耐阿德福韋N236T變異HBV穩(wěn)定細(xì)胞株，命名為HepG2-HS236T。同時篩選出一株表

5、達(dá)耐阿德福韋A181V變異HBV穩(wěn)定細(xì)胞株。采用Southern blot技術(shù)證實(shí)該細(xì)胞株胞內(nèi)HBV復(fù)制水平顯著高于HepG2.2.15細(xì)胞株，上清液中HBsAg和HBeAg病毒蛋白水平顯著高于HepG2.2.15，達(dá)5倍以上。胞外分泌的病毒顆粒水平與HepG2.2.15相似。表型實(shí)驗(yàn)顯示了預(yù)期的表型耐藥特征，即對拉米夫定敏感以及對阿德福韋的敏感性明顯降低。HepG2-HS236T細(xì)胞株中同樣發(fā)現(xiàn)了以整合形式存在的HBV序列，采用常規(guī)電

6、鏡也發(fā)現(xiàn)了存在于細(xì)胞上清液中的病毒顆粒。長期傳代證實(shí)了其穩(wěn)定的生物學(xué)特性。而表達(dá)耐阿德福韋A181V變異HBV穩(wěn)定細(xì)胞株其病毒蛋白水平為HepG2.2.15 2-3倍左右，但胞內(nèi)HBV復(fù)制水平以及胞外HBV DNA分泌水平較低。
　　在研究的第四部分中，我們同樣應(yīng)用建立的篩選體系，篩選出一株耐恩替卡韋L180M+M204V+T184S變異型和一株L180M+M204V+M250L變異型HBV細(xì)胞株。但其胞內(nèi)HBV復(fù)制以及胞外HBV