新型核苷類似物dT-QX抗肝癌細胞活性及其作用機制的研究.pdf

1、近年來，肝癌因其高發(fā)病率、高死亡率而已成為我國重大疾病之一，因此研發(fā)安全有效的抗肝癌藥物既有重要的醫(yī)學意義，也有緊迫的市場需求。以索拉非尼為例，肝癌分子靶向治療已成為抗肝癌藥物研發(fā)的新方向和熱點。索拉非尼是一種多酪氨酸激酶抑制劑，它是目前唯一被批準用于治療晚期肝癌的口服藥物，其效果仍然有限只能暫時延緩肝癌發(fā)展。和酪氨酸激酶一樣，在癌細胞中普遍高表達的胸苷激酶（TKs）是一種潛在的抗癌分子靶標。已有針對TKs設計的化療藥物例如阿昔洛韋、齊

2、多夫定（AZT）等雖具有抗病毒活性，但在臨床上對癌癥治療并無療效。最新研究表明，上調(diào)肝癌患者的TKs并用核苷類似物的聯(lián)合治療方案同樣收效甚微。這可能是齊多夫定等核苷類似物整合入DNA后很容易經(jīng)DNA修復過程被清除掉。有鑒于此，在齊多夫定分子結(jié)構(gòu)基礎上，設計并合成了一種具有選擇性抗癌效果的新型核苷類似物dT-QX，該類似物具有脫氧胸苷（dT）與喹喔啉基團（QX）共價結(jié)合的分子結(jié)構(gòu)，其中的脫氧胸苷基團能夠被TKs識別，而喹喔啉基團則是一種已

3、知的DNA插入劑。本課題對dT-QX抗癌活性及其殺細胞機理進行研究，以期為核苷類化合物發(fā)展為更有效的抗腫瘤化療藥物積累必要的學術(shù)與實驗基礎。同時依據(jù)胸苷代謝和補救途徑的相關酶是其抗癌分子靶標，揭示其選擇性活性機制并在此基礎上尋求增加肝癌細胞對dT-QX敏感性的方法，旨在為針對臨床肝癌治療中存在的復雜多樣性提供合理可行的解決方案。
　　本課題主要研究工作總結(jié)如下：
　　（1）研究了dT-QX的抗癌活性。
　　結(jié)果：體外細

4、胞毒性實驗發(fā)現(xiàn)dT-QX能殺死多種癌細胞，包括人肝癌細胞Hep3B和HepG2、小鼠肝癌H22細胞、人乳腺癌細胞MCF-7以及大鼠腦膠質(zhì)瘤細胞C6，尤其對帶有乙肝病毒的肝癌細胞Hep3B毒性最強并且對人正常肝細胞HL-7702幾乎無毒，體內(nèi)實驗表明dT-QX在小鼠皮下H22肝癌腫瘤模型中瘤內(nèi)注射低劑量的dT-QX（相當于每只小鼠注射劑量為0.13毫克/千克/次，共兩次）能有效抑制腫瘤的生長?？疾靸煞N對照化合物AZT和Pip-QX后，發(fā)現(xiàn)

5、AZT幾乎無細胞毒性，而具有QX基團的化合物Pip-QX對癌細胞和正常肝細胞均表現(xiàn)明顯的細胞毒性，AZT與Pip-QX聯(lián)用結(jié)果與Pip-QX毒性相同。與臨床用抗癌藥物阿霉素比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)阿霉素對HL-7702毒性非常大，但dT-QX對其幾乎無毒。
　　結(jié)論：dT-QX具有選擇性抗肝癌活性，而且較于阿霉素對于人正常肝細胞更安全。dT-QX的選擇性抗癌活性是通過dT和QX兩個功能基團獨特的共價結(jié)合結(jié)構(gòu)來實現(xiàn)的，dT基團靶向癌細胞，QX

6、則誘導癌細胞死亡。
　?。?）初步探索了dT-QX在肝癌細胞中如何誘導細胞死亡。
　　結(jié)果：經(jīng)Alexa Fluor488?鬼筆環(huán)肽分析細胞完整性觀察到dT-QX能破壞Hep3B細胞結(jié)構(gòu)，但對人正常肝細胞HL-7702的結(jié)構(gòu)和形態(tài)沒有影響。BrdU細胞增殖檢測發(fā)現(xiàn)dT-QX能抑制肝癌細胞HepG2和Hep3B的DNA合成，且效果對于Hep3B更明顯，但其對HL-7702幾乎無影響，這與以上細胞活性MTT檢測結(jié)果一致，dT-Q

7、X對Hep3B的作用比HepG2更強，可能由于Hep3B是乙肝病毒感染細胞株的緣故；考察對照化合物發(fā)現(xiàn)AZT并不能抑制細胞DNA合成，Pip-QX則能顯著抑制細胞DNA合成。線粒體超氧化物熒光學分析顯示在Hep3B細胞DNA合成被抑制后，dT-QX會使Hep3B細胞線粒體產(chǎn)生大量超氧化物，其對HL-7702細胞幾乎無影響。
　　結(jié)論：dT-QX能選擇性抑制肝癌細胞核內(nèi)DNA合成，并且這種作用是由其分子結(jié)構(gòu)上的QX基團來實現(xiàn)的。dT

8、-QX是通過抑制肝癌細胞DNA的合成誘導其發(fā)生線粒體超氧化物應激引起細胞線粒體功能障礙從而導致細胞死亡。
　　（3）闡明了dT-QX的選擇性活性機理并確定了增強肝癌細胞對dT-QX敏感性的方法。
　　結(jié)果：采用細胞器熒光染料以及細胞器熒光共定位分析試劑檢測到細胞攝入dT-QX后dT-QX是定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中（內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中具有TK1），顯示dT-QX可能是通過TK1磷酸化活化的。改變細胞胸苷濃度分析dT-QX活性發(fā)現(xiàn)細胞胸苷濃度增加，

9、不會影響dT-QX活性（10μM以上濃度），但會導致dT-QX對Hep3B的半數(shù)效應濃度EC50變大；細胞胸苷濃度減少，對dT-QX在Hep3B細胞上的半數(shù)效應濃度EC50無影響，但細胞毒性有明顯加和作用。分析dT-QX選擇性活性與細胞TK1和TYMP表達水平之間的關聯(lián)性表明dT-QX在四種具有TK1高表達的肝癌細胞Hep3B、HepG2、Bel-7402、Bel-7404中表現(xiàn)出明顯的細胞毒性，而對于TK1含量很低的人正常肝細胞HL-

10、7702幾乎無毒；并且dT-QX在TK1高表達，TYMP幾乎不表達的Hep3B細胞上毒性最強，在TK1表達量最低的人正常肝細胞HL-7702上毒性最弱，在TK1高表達但TYMP同樣高表達的Bel-7402細胞上毒性較其它肝癌細胞要低。進一步通過調(diào)控細胞中TK1或TYMP蛋白水平分析dT-QX活性發(fā)現(xiàn)，經(jīng)siRNA干擾，在Hep3B中下調(diào)TK1可明顯降低dT-QX活性，下調(diào)TYMP不影響其活性，因為Hep3B幾乎不表達TYMP，siRNA

11、干擾對Hep3B的TYMP表達量無影響；對于Bel-7402，下調(diào)TK1也降低了dT-QX活性，下調(diào)TYMP則使其活性明顯提高。在Hep3B和Bel-7402細胞上用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染過表達TK1，結(jié)果顯示整合TK1基因的陽性質(zhì)粒和陰性對照質(zhì)粒都能使兩種細胞過表達TK1，這可能是由于陰性對照質(zhì)粒的載體上具有CMV強啟動子能啟動某些基因的非特異表達；而且在兩種細胞中過表達TK1都能提高dT-QX的活性。最后采用能穩(wěn)定表達且表達特異性強的慢病毒轉(zhuǎn)導方

12、法上調(diào)細胞TK1，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TK1基因重組慢病毒顆粒能上調(diào)細胞TK1并且不會影響TYMP的表達情況，而陰性對照慢病毒顆粒也不會影響目的蛋白表達量；與之前過表達TK1結(jié)果一致，上調(diào)TK1使dT-QX抗Hep3B和Bel-7402細胞活性明顯提高。
　　結(jié)論：dT-QX是TKs的底物，它在細胞中由TKs磷酸化后活化。dT-QX的選擇性活性與細胞的TK1和TYMP表達量有關，TK1低表達會降低dT-QX活性。在肝癌細胞中上調(diào)TK1能增加肝