靶向肝癌細(xì)胞的納米硒化anisomycin的抗瘤活性及其機(jī)制.pdf

1、肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最常見的一種肝臟腫瘤。肝癌具有病情發(fā)展快、惡性度高、生存期短等特點。臨床上治療癌癥的主要方法有手術(shù)切除、放射性治療和藥物化療,手術(shù)切除仍然是治療肝癌的首選。然而,即使手術(shù)切除后，患者在五年內(nèi)的肝癌復(fù)發(fā)率和轉(zhuǎn)移率都很高，這給臨床上肝癌治療帶來了極大的挑戰(zhàn)。而且，肝癌患者在確診時通常已發(fā)展到中晚期，失去了手術(shù)治療的最佳時機(jī)。目前，藥物化療是治療癌癥普遍使用的一種策略。常用

2、的化療藥物缺乏選擇性，具有很大的毒副作用。因此，傳統(tǒng)的化療對肝癌的治療效果非常有限。
　　納米材料的興起為抗癌藥物的發(fā)展帶來新的契機(jī)。開發(fā)安全、穩(wěn)定、靶向以及藥物可控釋放的多功能藥物載體對人類腫瘤的診斷和治療都具有重要意義。納米材料具有表面積大、生物兼容性好以及易于修飾等優(yōu)良特點，可實現(xiàn)抗癌藥物的高效、靶向投遞。因此，發(fā)展納米材料載體用于靶向運輸藥物給抗癌藥物的發(fā)展帶來新的曙光。
　　癌細(xì)胞由于分裂生長迅猛、活動旺盛，因此形

3、成了不同于正常組織、細(xì)胞的病理和代謝變化：新生腫瘤血管結(jié)構(gòu)不完整，腫瘤血管的滲透滯留效應(yīng)增強(qiáng)（enhanced permeability and retention，EPR），無氧代謝、生長失控和跨膜pH調(diào)節(jié)能力提升形成的腫瘤細(xì)胞外部弱酸環(huán)境和腫瘤細(xì)胞表面相關(guān)受體的表達(dá)上調(diào)。這些不同于正常組織的病理特征，正好為靶向納米遞藥系統(tǒng)的設(shè)計和應(yīng)用提供了依據(jù)。針對肝臟腫瘤細(xì)胞表面或細(xì)胞內(nèi)某些受體分子高表達(dá)特性，本文設(shè)計合成了3種功能化納米硒SeN

4、Ps@Am、HA-SeNPs@Am和HT-SeNPs@Am載藥系統(tǒng)，探索它們對肝癌細(xì)胞的選擇性、抗腫瘤活性及其機(jī)制，旨在尋找潛在的抗肝癌靶向藥物。全文共分為四個章節(jié)。
　　第一章：緒論
　　簡要介紹目前肝癌發(fā)展的現(xiàn)狀，傳統(tǒng)化療藥物的不足和局限以及納米藥物載體用于腫瘤治療的優(yōu)勢。重點介紹了納米硒作為抗腫瘤藥物載體的優(yōu)勢以及anisomycin在抗腫瘤方面的研究進(jìn)展。最后介紹本課題的選題依據(jù)、意義及其創(chuàng)新點。
　　第二章：

5、被動靶向肝癌細(xì)胞的功能化納米硒SeNPs@Am的制備、抗腫瘤活性及其機(jī)制
　　被動靶向的原理是基于EPR效應(yīng)將藥物負(fù)載在納米尺寸的載體上，經(jīng)血液循環(huán)靶向進(jìn)入腫瘤組織，從而實現(xiàn)組織水平的腫瘤靶向。同時結(jié)合腫瘤細(xì)胞外微酸環(huán)境，實現(xiàn)藥物的有效釋放。基于這點，將細(xì)菌源性小分子抗生素anisomycin（Am）負(fù)載于納米硒 SeNPs上，制備功能化納米硒 SeNPs@Am，實現(xiàn)藥物anisomycin的被動靶向輸送至人肝癌細(xì)胞的目的。

6、>　　SeNPs@Am的合成路徑如下：通過維生素C（vitamin C，Vc）還原亞硒酸鈉（Na2SeO3），嘗試多種條件下制備不同粒徑的納米硒（selenium nanparticles， SeNPs）載體，選擇最佳粒徑SeNPs作為納米硒載體，在其表面負(fù)載anisomycin，制備納米硒化SeNPs@Am。與未修飾的SeNPs相比，anisomycin修飾使得納米硒粒徑更小，分散更均勻。此外，在納米硒表面連接香豆素-6，使得該納米藥

7、物載體帶有綠色熒光，利于研究SeNPs@Am的細(xì)胞攝取行為。
　　探索不同粒徑下的SeNPs@Am在HepG2細(xì)胞內(nèi)的吸收，發(fā)現(xiàn)粒徑為56 nm的SeNPs@Am在HepG2細(xì)胞內(nèi)的吸收量最大。因此，選取該粒徑的SeNPs@Am用于后續(xù)生物功能實驗的研究；通過透射電鏡、元素分析和納米粒度儀等分析SeNPs@Am的形貌、元素組成及粒徑大?。焕眉t外光譜和核磁共振儀表征SeNPs@Am分子結(jié)構(gòu)信息；藉熒光顯微鏡和電感耦合等離子體質(zhì)譜（

8、Inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）弄清SeNPs@Am在細(xì)胞中的定性和定量吸收及其胞內(nèi)的定位；運用藥物釋放試驗觀察 SeNPs@Am在不同pH條件下anisomycin的釋放；借助不同內(nèi)吞抑制劑確定SeNPs@Am在HepG2細(xì)胞中的內(nèi)吞方式；采用MTT法檢測SeNPs@Am處理后HepG2細(xì)胞的增殖；流式細(xì)胞術(shù)分析 SeNPs@Am處理后HepG2細(xì)胞的周期和凋亡變

9、化；TUNEL-DAPI雙染色進(jìn)一步確證 SeNPs@Am在HepG2細(xì)胞凋亡中的作用；細(xì)胞劃痕和 Transwell試驗觀察SeNPs@Am對HepG2細(xì)胞遷移的影響；Western Blot分析SeNPs@Am處理后 HepG2細(xì)胞的周期調(diào)控蛋白和凋亡相關(guān)蛋白變化與細(xì)胞生物學(xué)行為的關(guān)系;比較SeNPs@Am與anisomycin的作用差異。
　　結(jié)果表明，成功合成了功能化納米硒 SeNPs@Am；SeNPs@Am在 HepG2

10、細(xì)胞攝取量高于未修飾的SeNPs；SeNPs@Am通過巨胞飲介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入細(xì)胞，阻滯細(xì)胞在 G0/G1期，促進(jìn)HepG2細(xì)胞凋亡和抑制細(xì)胞遷移，這主要通過激活P53/P73/P21/P27和caspase-9/caspase-8/caspase-3信號，并下調(diào) CDK-2和ICBP90的活性而實現(xiàn)，似乎與P16、Rb和E2F1無關(guān)；在等量anisomycin下， SeNPs@Am較anisomycin顯現(xiàn)更強(qiáng)的抑制HepG2細(xì)胞生長

11、和遷移并誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞凋亡的活性。結(jié)果提示，將 anisomycin負(fù)載于SeNPs形成功能化納米硒SeNPs@Am后，具有一定的被動靶向抗肝癌活性，其作用優(yōu)于未修飾的anisomycin。
　　第三章：主動靶向肝癌細(xì)胞的功能化納米硒HA-SeNPs@Am的制備、抗腫瘤活性及其機(jī)制
　　通過 EPR效應(yīng)只能實現(xiàn)有限的組織水平上的腫瘤靶向，除了腫瘤細(xì)胞外的微酸環(huán)境，腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)的受體可用作靶點，通過在納米載體上修飾可

12、以與這些受體產(chǎn)生特異性結(jié)合的靶向分子，從而實現(xiàn)主動靶向腫瘤細(xì)胞的策略。這需要選擇合適的受體和與之相結(jié)合的靶向分子。文獻(xiàn)表明，透明質(zhì)酸（hyaluronic acid，HA）的受體CD44分子在肝腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá)，因此，HA可作為腫瘤靶向分子用于設(shè)計靶向肝癌的納米載藥系統(tǒng)。
　　HA-SeNPs@Am的合成路徑如下：將Na2SeO3溶液滴加至Vc與anisomycin混合溶液后，形成功能化納米硒SeNPs@Am，在其表面連接HA，

13、制備主動靶向肝癌細(xì)胞的納米硒化HA-SeNPs@Am。在納米硒表面連接香豆素-6和Cy5.5，使得該納米藥物載體分別帶有綠色和紅色熒光，利于研究 HA-SeNPs@Am的細(xì)胞攝取和體內(nèi)分布。
　　同上方法分析 HA-SeNPs@Am的形貌、元素組成及粒徑大小，表征HA-SeNPs@Am分子結(jié)構(gòu)信息，弄清 HA-SeNPs@Am在 RT-112、HepG2、HUVEC-12和Lo-2細(xì)胞中的定性和定量吸收及其胞內(nèi)定位，觀察HA-Se

14、NPs@Am在不同pH條件下anisomycin的釋放，確定HA-SeNPs@Am在HepG2細(xì)胞中的內(nèi)吞方式，檢測HA-SeNPs@Am對RT-112、HepG2、HUVEC-12和Lo-2細(xì)胞增殖的抑制效果，分析HA-SeNPs@Am處理RT-112、HepG2、HUVEC-12和Lo-2細(xì)胞后細(xì)胞周期和凋亡的變化，測定HA-SeNPs@Am處理后RT-112、HepG2、HUVEC-12和Lo-2細(xì)胞遷移的變化，探明HA-SeNP

15、s@Am處理后HepG2細(xì)胞的周期調(diào)控蛋白和凋亡相關(guān)蛋白變化與細(xì)胞生物學(xué)行為的關(guān)系；比較HA-SeNPs@Am與SeNPs@Am對HepG2細(xì)胞生物學(xué)行為的作用差異。
　　有文獻(xiàn)報道，轉(zhuǎn)錄因子 Oct4、Sox2和 Nanog在肝癌干細(xì)胞中高表達(dá)，且Oct4在肝癌干細(xì)胞凋亡中扮演著重要角色。那么，HA-SeNPs@Am是否通過Oct4影響HepG2細(xì)胞凋亡及其與Sox2和Nanog之間的關(guān)系？因此，利用單獨或聯(lián)合敲低oct4、so

16、x2和nanog基因策略，通過流式細(xì)胞術(shù)、qPCR和Western Blot分析HA-SeNPs@Am誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞的凋亡與Oct4、Sox2、Nanog的mRNA和蛋白表達(dá)的關(guān)系，以及與GSK-3β和β-catenin表達(dá)的關(guān)聯(lián)；進(jìn)一步通過荷瘤裸鼠模型評價HA-SeNPs@Am在RT-112和HepG2不同腫瘤組織中的靶向分布和體內(nèi)治療效果。
　　結(jié)果表明，成功合成了肝癌靶向的功能化納米硒 HA-SeNPs@Am，它在RT-

17、112、HepG2、HUVEC-12和 Lo-2細(xì)胞間的生物活性具有選擇性；與SeNPs@Am比較，HA-SeNPs@Am靶向HepG2細(xì)胞活性更高，抑制細(xì)胞生長的作用更強(qiáng)；體內(nèi)試驗證實HA-SeNPs@Am能靶向聚集于HepG2肝癌組織內(nèi)發(fā)揮抗腫瘤作用。結(jié)果提示，HA-SeNPs@Am具有主動靶向抗肝癌活性，其作用優(yōu)于SeNPs@Am；HA-SeNPs@Am除了通過激活P53/P73/P21/P27和JNK/Bim/caspase-9

18、/caspase-8/caspase-3信號，抑制ICBP90和Bcl-xL的活性而發(fā)揮作用外，還通過激活肝癌細(xì)胞中GSK-3β，抑制β-catenin，下調(diào)Oct4、Sox2和Nanog的水平，抑制肝癌干細(xì)胞增殖，從而抑制肝臟腫瘤的生長；此作用可能也與HA-SeNPs@Am阻止CD4+T細(xì)胞向Treg、Th17和Th22細(xì)胞分化，上調(diào)TNF-α和IFN-γ，抑制TGF-β和IL-10分泌有關(guān)。
　　第四章：主動靶向肝癌細(xì)胞的功能

19、化納米硒 HT-SeNPs@Am的制備、抗腫瘤活性及其機(jī)制
　　有文獻(xiàn)報道，5-羥色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）受體在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)?；谶@點，我們將肝癌靶向分子5-HT連接在負(fù)載抗腫瘤藥物anisomycin的功能化納米硒表面，制備一種新型的靶向肝癌的納米硒化HT-SeNPs@Am。通過5-HT與肝癌細(xì)胞高表達(dá)的5-HT受體分子的特異性結(jié)合來實現(xiàn)anisomycin向肝癌細(xì)胞靶向投遞的目的。
　

20、　HT-SeNPs@Am的合成路徑如下：將Na2SeO3溶液滴加至Vc與anisomycin混合溶液后，形成功能化納米硒SeNPs@Am，在其表面連接5-HT，制備靶向肝癌細(xì)胞的納米硒化HT-SeNPs@Am。在納米硒表面連接香豆素-6和Cy5.5，使得該納米藥物載體分別帶有綠色和紅色熒光，利于研究 HT-SeNPs@Am的細(xì)胞攝取和體內(nèi)分布。
　　同上方法分析 HT-SeNPs@Am的形貌、元素組成及粒徑大小，表征HT-SeNP

21、s@Am分子結(jié)構(gòu)信息，弄清HT-SeNPs@Am在HepG2、Lo-2、HUVEC-12和 A549細(xì)胞中的吸收及其胞內(nèi)定位，觀察 HT-SeNPs@Am在不同條件下anisomycin的釋放，確定 HT-SeNPs@Am在 HepG2細(xì)胞中的內(nèi)吞方式，檢測HT-SeNPs@Am對HepG2、Lo-2、HUVEC-12和A549細(xì)胞增殖的抑制效果，分析 HT-SeNPs@Am處理后 HepG2的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的變化，測定HT-SeN

22、Ps@Am處理后HepG2、Lo-2、HUVEC-12和A549細(xì)胞遷移的變化，探明HT-SeNPs@Am處理后HepG2細(xì)胞內(nèi)Stat1、Stat3、c-jun、Bim、E2F2和HIF-1α蛋白表達(dá)變化與細(xì)胞生物學(xué)行為的關(guān)系。單獨或聯(lián)合敲低 stat3、hif-1α和 e2f2基因，進(jìn)一步確定Stat3、HIF-1α和E2F2之間的關(guān)系。評價HT-SeNPs@Am在RT-112和 HepG2不同腫瘤組織中的靶向分布和體內(nèi)治療效果，比

23、較HT-SeNPs@Am與HA-SeNPs@Am的作用差異。
　　結(jié)果表明，成功合成了肝癌靶向的功能化納米硒 HT-SeNPs@Am，其在HepG2、Lo-2、HUVEC-12和A549細(xì)胞中的生物活性具有選擇性；與anisomycin比較，HT-SeNPs@Am能靶向 HepG2細(xì)胞，抑制細(xì)胞生長的作用更強(qiáng)；與HA-SeNPs@Am比較，HT-SeNPs@Am對HepG2細(xì)胞的選擇性及其生物學(xué)行為的影響相似，體內(nèi)試驗證實HT-S

24、eNPs@Am能靶向聚集于HepG2肝癌組織內(nèi)發(fā)揮更明顯的抗腫瘤作用。結(jié)果提示，HT-SeNPs@Am具有主動靶向抗肝癌活性，其作用稍優(yōu)于HA-SeNPs@Am；HT-SeNPs@Am可能通過激活c-jun/Bim/Stat1信號，下調(diào) Stat3、HIF-1α和 E2F2的水平，阻止肝癌細(xì)胞增殖，從而抑制腫瘤的生長。此作用可能也與HA-SeNPs@Am阻止CD4+T細(xì)胞向Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞和Th22細(xì)胞分化，上調(diào)TNF-α和I