基于miR-199調(diào)控靶向肝癌細(xì)胞的溶瘤腺病毒系統(tǒng)研究.pdf

1、肝癌嚴(yán)重威脅著我國人民生命健康?；?病毒治療是繼手術(shù)、放療、化療之后，肝癌靶向治療的一種非常有前景的生物治療方案。其中，溶瘤腺病毒本身具有裂解腫瘤的能力，又能介導(dǎo)外源基因高效表達(dá)，已成為基因-病毒治療領(lǐng)域重要載體。目前己建立多種腺病毒調(diào)控策略，使其特異殺傷腫瘤細(xì)胞，而對正常組織細(xì)胞基本無毒性。然而，野生型腺病毒對肝臟具有較強的嗜性，如何減少甚至避免腺病毒對正常肝細(xì)胞的毒性，仍是應(yīng)用腺病毒作為載體開展肝癌基因-病毒治療所面臨的巨大挑戰(zhàn)。

2、
　　 microRNA(miRNA)是生物體內(nèi)源，長度約為19-25個核苷酸的非編碼小RNA，它能通過與靶基因mRNA上的靶序列互補配對結(jié)合，在轉(zhuǎn)錄后水平對基因表達(dá)起負(fù)調(diào)控作用，導(dǎo)致mRNA的降解或翻譯抑制。研究表明，miRNA具有高度的時空表達(dá)特異性，一些特定的miRNA常在一類腫瘤細(xì)胞(如肝癌)中異常下調(diào)，與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。因而，可以根據(jù)microRNA的調(diào)控方式與表達(dá)特點，將miRNA引入溶瘤腺病毒的靶向性調(diào)控中，

3、即利用肝癌細(xì)胞特異性下調(diào)的miRNA調(diào)控腺病毒增殖必需基因E1A的表達(dá)，使其在相應(yīng)miRNA高水平表達(dá)的正常肝細(xì)胞內(nèi)不增殖(E1A被抑制)，而在相應(yīng)miRNA表達(dá)缺失的肝癌細(xì)胞內(nèi)有效增殖(E1A正常表達(dá))，從而特異殺傷肝癌細(xì)胞，避免對正常肝細(xì)胞的毒副作用。
　　 miR-199a/b-3p是正常肝細(xì)胞內(nèi)一種表達(dá)量非常高的miRNA(絕對表達(dá)量居第三)，且在多種類型組織中高水平表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，miR-199a/b-3p在肝癌細(xì)胞內(nèi)

4、廣譜低水平表達(dá)。在本研究中，我們將miR-199a/b-3p靶序列插入E1A的3’非翻譯區(qū)中，同時將5型腺病毒纖毛替換為5/35型嵌合纖毛，以提高病毒對腫瘤細(xì)胞的感染效率，建立基于miR-199調(diào)控靶向肝癌細(xì)胞的溶瘤腺病毒載體系統(tǒng)。通過Westernblotting、RT-PCR等技術(shù)研究在該調(diào)控方式作用下，腺病毒E1A的表達(dá)情況；通過病毒增殖實驗、綠色熒光報告系統(tǒng)等手段檢測病毒的增殖特性；應(yīng)用MTT法檢測病毒對肝癌細(xì)胞的體外殺傷作用及

5、對正常肝細(xì)胞的毒副作用；建立肝癌細(xì)胞裸鼠移植瘤模型，研究病毒對移植瘤的抑制作用。
　　 結(jié)果表明，包含8個拷貝miR-199a/b-3p靶序列的溶瘤腺病毒SG7035199T能在miR-199a/b-3p低表達(dá)的肝癌細(xì)胞株(Hep3B與Huh7)中有效增殖并發(fā)揮殺傷作用，病毒感染后EIA能正常表達(dá)；而在miR-199a/b-3p高表達(dá)的正常肝細(xì)胞株(L02)及卵巢癌細(xì)胞株(SK-OV3)中基本不增殖，基本不發(fā)揮殺傷作用，病毒感染

6、后E1A被有效抑制。而對照病毒，如包含5/35型嵌合纖毛，不具有任何調(diào)控的增殖型腺病毒W(wǎng)Ad5/35以及包含8個拷貝“種子”序列突變后的miR-199a/b-3p靶序列的溶瘤腺病毒SG7035199MT則能在Hep3B、Huh7、L02、SK-OV3中均能有效增殖并發(fā)揮殺傷作用。體內(nèi)方面，SG7035199T能有效抑制Hep3B移植瘤的生長，其抑瘤能力與WAd5/35、SG7035199MT相當(dāng)；對于SK-OV3移植瘤，SG703519