CIK細胞聯(lián)合表達白介素12的溶瘤腺病毒治療肝癌的療效及機制研究.pdf

1、本文從以下兩部分進行論述：
　　第一部分:研究表達IL-12的雙靶向溶瘤腺病毒聯(lián)合CIK細胞對肝癌的治療效果
　　目的:
　　探討CIK細胞聯(lián)合表達IL-12的溶瘤腺病毒的體內(nèi)外抗腫瘤作用，分析其聯(lián)合抗腫瘤作用的機制，為“細胞-病毒-基因”聯(lián)合療法提供實驗基礎(chǔ)。
　　方法:
　　利用細菌重組技術(shù)，在課題組雙靶向性溶瘤病毒AdCN205系統(tǒng)的基礎(chǔ)上構(gòu)建表達IL-12基因的腫瘤特異性溶瘤病毒AdCN205-IL

2、12;通過檢測溶瘤病毒AdCN205-IL12在BEL7404、HuH-7、SMMC7721等腫瘤細胞系和正常肝細胞AKN-1中的病毒復(fù)制能力，IL-12基因表達水平，來驗證其腫瘤特異性;通過對比溶瘤病毒AdCN205-IL12對腫瘤細胞BEL7404、HuH-7、Hep3B和正常肝細胞AKN-1的體外殺傷作用，來驗證其腫瘤靶向殺傷能力;通過表達熒光素酶的慢病毒載體pCDH-EF1α-Luciferase-2A-mCherry構(gòu)建穩(wěn)定表

3、達Luciferase的靶細胞系，檢測CIK與溶瘤病毒聯(lián)合殺傷后靶細胞系HuH-7和Hep3B中殘余Luciferase的酶活性，替代Cr51同位素釋放試驗來研究CIK細胞聯(lián)合溶瘤病毒的體外殺傷效果;通過免疫組化標(biāo)記人CD3分子研究CIK細胞浸潤腫瘤組織的情況，通過免疫組化標(biāo)記CD34分子研究腫瘤血管密度，研究CIK聯(lián)合表達IL-12的溶瘤腺病毒的抗腫瘤作用機制。
　　結(jié)果:
　　通過對體外培養(yǎng)14天的CIK細胞進行檢測，結(jié)

4、果顯示CD3陽性的T細胞占總細胞群體的94.05％±6.74％，CD3/CD4雙陽性的Th細胞占總細胞群體的12.13±1.58％，CD3/CD8陽性的CTL細胞占總細胞群體的69.2％±4.75％，CD3/CD56雙陽性的NKT細胞占總細胞群體的25.48±4.77％，CD3-/CD56+的NK細胞占總細胞的5.33％±4.32％，共有83.5±3.87％的細胞表達與腫瘤非特異殺傷相關(guān)的NKG2D分子。此結(jié)果與以往的報道的CIK細胞表

5、型一致。AdCN205-IL12和AdCN205-GFP對腫瘤細胞具有較強的殺傷能力，但兩者之間無差異。說明IL-12基因不能提高溶瘤病毒的體外殺傷作用能力。表達IL-12的非復(fù)制型病毒AdIL-12體外對腫瘤細胞也無殺傷作用。說明單純的IL-12對腫瘤細胞無直接殺傷效果。在效靶20∶1的情況下，IL-12提升CIK細胞的體外抗腫瘤作用，由14.37％±2.24％提升至34.68％±1.78％，P=0.000553，在40∶1的情況下抗

6、腫瘤作用由51.50％±1.19％提升至70.23％±0.96％，p=0.001979，提示IL-12可以顯著提升CIK細胞對肝癌細胞的抑制作用;在效靶比10∶1，病毒感染系數(shù)為10MOI的情況下，對于肝癌細胞系HuH-7，在48h的時間點，CIK細胞聯(lián)合AdCN205-GFP組較單CIK組，腫瘤細胞存活率降低，差異顯著(n=3，p=0.0260)，CIK細胞聯(lián)合AdCN205-IL12組較單CIK組腫瘤細胞存活率降低，差異極顯著(n=

7、3，p=0.0018);72h的時間點CIK聯(lián)合AdCN205-IL12組較聯(lián)合AdCN205-GFP組的腫瘤抑制作用更強，差異顯著(n=3，p=0.0135);在效靶比10∶1，病毒感染系數(shù)為10MOI的情況下，對于肝癌細胞系Hep3B，CIK細胞聯(lián)合AdCN205-IL12組較單CIK組腫瘤細胞存活率降低，差異極顯著(p=0.0001)，較單獨AdCN205-GFP組腫瘤細胞存活率降低，差異極顯著(p=0.00026)，較單獨AdC

8、N205-IL12組腫瘤細胞存活率降低，差異極顯著(p=0.00032)，較CIK聯(lián)合AdCN205-GFP組腫瘤細胞存活率降低，差異極顯著(p=0.00027)。在72h的時間點，CIK細胞聯(lián)合AdCN205-IL12病毒組較其他各組均有極顯著的抑制效果(P＜0.001)。提示CIK細胞聯(lián)合溶瘤病毒可提升對腫瘤細胞的抑制作用，表達IL-12基因可進一步提升抗腫瘤效果。體內(nèi)移植瘤模型治療結(jié)果顯示，單一治療組(AdCN205-GFP，Ad

9、CN205-IL12，CIK)相對PBS組而言具有一定的腫瘤抑制效果，且差異極顯著(n=8，p＜0.001)，但是單一治療組之間并無顯著差異。CIK細胞聯(lián)合AdCN205-GFP組較單一治療組AdCN205-GFP(n=8，p=0.02)和CIK(n=8，p=0.008)具有顯著差異。 CIK細胞聯(lián)合AdCN205-IL12組具有最強的抗腫瘤作用，其較所有單一治療組具有極顯著差異(n=8，p＜0.001)，較CIK聯(lián)合AdCN205-G

10、FP組抗腫瘤效果更顯著(n=8，p=0.047)。治療過程中發(fā)現(xiàn)，CIK細胞聯(lián)合AdCN205-IL12組中有2只小鼠腫瘤完全消失。在小鼠生存時間上，PBS組與其它各治療組間均有統(tǒng)計學(xué)差異。但各治療組間差異不顯著。體內(nèi)移植瘤模型治療結(jié)果顯示，CIK聯(lián)合AdCN205-IL12組，CIK聯(lián)合AdCN205-GFP組，及單AdCN205-GFP組的瘤組織出現(xiàn)大量壞死，而PBS組，CIK組及AdCN205-IL2組壞死區(qū)域相對較少;CIK聯(lián)合

11、AdCN205-IL12組浸潤的人源CD3陽性的細胞數(shù)顯著高于其他組。說明IL-12可增強CIK細胞的浸潤或促進CIK細胞在腫瘤細胞內(nèi)的增殖或存活;GFP或IL-12僅在腫瘤組織有表達，而在肝臟組織中未檢測到GFP或IL-12的表達，提升CIK聯(lián)合溶瘤病毒治療不影響外源基因在組織中表達的特異性。免疫組化的結(jié)果顯示病毒僅在腫瘤細胞中能夠檢測出來，而在正常肝臟中檢測不到病毒Hexon的存在，提示CIK聯(lián)合病毒治療不影響病毒復(fù)制的特異性。

12、r>　　結(jié)論:
　　CIK細胞聯(lián)合表達IL-12基因的雙靶向性溶瘤病毒AdCN205-IL12具有協(xié)同抗腫瘤作用，發(fā)現(xiàn)溶瘤病毒的腫瘤裂解作用和腫瘤局部高濃度IL-12的表達增加了CIK細胞在腫瘤組織內(nèi)的浸潤數(shù)量，增強了CIK細胞的抗腫瘤作用，實現(xiàn)了“細胞-病毒-基因”強強聯(lián)合的治療效果。
　　第二部分:CIK細胞運載Ad5/11嵌合型病毒靶向肝癌治療的機制研究
　　目的:
　　針對肝癌彌撒生長或廣泛轉(zhuǎn)移的特性，探

13、討CIK細胞運載Ad5/11嵌合型病毒實現(xiàn)血液系統(tǒng)給藥的可行性，并研究病毒轉(zhuǎn)載及轉(zhuǎn)移的相關(guān)機制。
　　方法:
　　流式細胞技術(shù)檢測CIK細胞表面CAR、αvβ5、αvβ3、CD46分子的表達情況;通過Ad5-CMV-GFP病毒感染CIK細胞，并檢測細胞GFP陽性率研究5型病毒對CIK細胞的感染情況;通過Ad5-CMV-GFP-11F嵌合病毒感染CIK細胞檢測細胞GFP陽性率研究Ad5/11型病毒對CIK細胞的感染能力;通過T

14、exsa Red標(biāo)記病毒于激光共聚焦顯微鏡下觀察病毒結(jié)合CIK細胞的能力;通過Texas Red標(biāo)記病毒，F(xiàn)ITC標(biāo)記CD46分子，研究病毒感染CIK細胞的過程與CD46分子的相關(guān)性;通過體外模擬CIK細胞在血液運輸過程中受到的剪切作用，病毒感染CIK細胞后，通過10倍體積的PBS洗滌，再將洗滌后的CIK細胞與腫瘤細胞共培養(yǎng)，觀察病毒轉(zhuǎn)移情況;通過CIK細胞攜帶AdCN205系統(tǒng)的溶瘤腺病毒，研究經(jīng)CIK細胞攜帶的病毒是否保持感染、增殖

15、和基因表達活力，以及體外抗腫瘤能力;體外檢測CIK攜帶溶瘤病毒對肝癌HuH-7細胞和PLC/RPF/5細胞的殺傷作用;通過DiO標(biāo)記CIK細胞膜，Texsa Red標(biāo)記病毒于激光共聚焦顯微鏡下觀察病毒由CIK細胞轉(zhuǎn)移至腫瘤細胞的過程;研究病毒轉(zhuǎn)移過程與細胞膜的相關(guān)作用的關(guān)系;通過細胞松弛素D抑制細胞骨架運動，研究病毒轉(zhuǎn)移過程與病毒骨架的運動的相關(guān)性;
　　結(jié)果:
　　CIK細胞表面不表達CAR、αvβ5、αvβ3等與5型腺病

16、毒感染相關(guān)的受體分子，而大量表達與11型腺病毒感染細胞相關(guān)的補體調(diào)節(jié)分子CD46受體;且5型腺病毒無法感染和吸附CIK細胞;Ad5/11嵌合型腺病毒可吸附于CIK細胞表面，在100MOI感染系數(shù)下對CIK細胞的感染效率可達到45.2±3.4％; Ad5/11嵌合型腺病毒可感染上皮來源的腫瘤細胞，感染效率與Ad5型病毒無差異;Ad5/11嵌合型腺病毒可在細胞表面引起極化作用，但病毒進入CIK細胞的能力有限;裝載Ad5/11嵌合型腺病毒的C

17、IK細胞與腫瘤細胞共培養(yǎng)后，病毒可由CIK細胞表面轉(zhuǎn)移至腫瘤細胞;CIK可攜帶Ad5/11嵌合型瘤腺病毒并將病毒轉(zhuǎn)移至腫瘤細胞，并保持溶瘤病毒的殺傷活性，對于HuH-7細胞，72h時CIK細胞攜帶AdCN205-GFP-11F組腫瘤細胞存活率顯著低于單CIK組(p=0.0008)，和CIK攜帶AdCN205-GFP組(p=0.0168);對于PLC/RPF/5細胞，72h時CIK細胞攜帶AdCN205-GFP-11F組PLC/PRF/5

18、細胞存活率顯著低于單CIK組(p＜0.0001)，和CIK攜帶AdCN205-GFP組(p=0.005);Ad5/11嵌合型腺病毒由CIK細胞表面轉(zhuǎn)移至腫瘤細胞依賴于CIK細胞與腫瘤細胞間膜的相互作用;通過細胞松弛素D抑制細胞骨架的運動可抑制病毒的轉(zhuǎn)移過程;
　　結(jié)論:
　　Ad5/11嵌合型腺病毒可感染和吸附CIK細胞，攜帶Ad5/11嵌合型腺病毒的CIK細胞通過CIK細胞與腫瘤細胞膜之間的相互作用將病毒轉(zhuǎn)移至腫瘤細胞中，