肝癌選擇性溶瘤腺病毒的構(gòu)建及其體外抑瘤作用.pdf

1、目的：構(gòu)建攜帶自殺基因、能夠選擇性在肝癌細(xì)胞中復(fù)制、并殺傷肝癌細(xì)胞的新型腺病毒載體，研究該載體在肝癌細(xì)胞及正常肝細(xì)胞中的復(fù)制與殺傷能力，以及聯(lián)合應(yīng)用前藥丙氧鳥苷（GCV）后對(duì)肝癌細(xì)胞殺傷效果的改善情況，為肝癌基因治療提供一種新的載體和工具。 方法：以肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞基因組DNA為模版，PCR擴(kuò)增甲胎蛋白基因（AFP）5’端300bp核心啟動(dòng)子順序（AFPp），以及被截短了的但包含兩個(gè)亞區(qū)的800bp增強(qiáng)子順序（AFPe）。

2、以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白（EGFP）及螢火蟲熒光蛋白（luc）的融合基因（EGFPluc）作為報(bào)告基因，構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒pAFPp-EGFPluc和pAFPe-AFPp-EGFPluc，通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因EGFP和Luciferase的表達(dá)鑒定AFPp和AFPe的活性，在質(zhì)粒水平上檢驗(yàn)含有啟動(dòng)子和增強(qiáng)子順序的人工啟動(dòng)子AFPe-AFPp是否比單獨(dú)的AFPp有更高的活性和特異性。分別構(gòu)建由AFPp或AFPep調(diào)控E1A表達(dá)的穿梭質(zhì)粒pDC311-A

3、FPp-E1A、pDC311-AFPep-E1A以及由AFPep調(diào)控E1A表達(dá)并攜帶自殺基因TK的穿梭質(zhì)粒pDC311-AFPep-E1A-CMV-TK，而后利用AdMax腺病毒包裝系統(tǒng)分別包裝出腺病毒Ad.AFPp-E1A、Ad.AFPep-E1A和Ad.AFPep-E1A-CMV-TK。利用Western blotting、病毒增殖測(cè)試、細(xì)胞病變、細(xì)胞活力等鑒定并比較Ad.AFPp-E1A和Ad.AFPep-E1A在選擇性復(fù)制能力和

4、溶瘤作用方面的差異，在病毒水平上檢驗(yàn)AFPep調(diào)控E1A的重組腺病毒是否比AFPp調(diào)控E1A的重組腺病毒有更好的選擇性；利用Western blotting、病毒增殖測(cè)試、細(xì)胞病變、病毒聯(lián)合前藥GCV對(duì)肝癌細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)等鑒定重組腺病毒Ad.AFPep-E1A-CMV-TK的選擇性復(fù)制能力和溶瘤作用。 結(jié)果：⑴通過(guò)檢測(cè)報(bào)告基因EGFP和Luciferase的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)AFPp和AFPep在肝癌細(xì)胞均具有一定的活性和特異性，其中A

5、FPep的活性和特異性更為明顯。⑵Ad.AFPp-E1A、Ad.AFPep-E1A感染人肝癌細(xì)胞（HepG2）以及正常肝細(xì)胞（chang liver細(xì)胞）后，Western bloting檢測(cè)ElA表達(dá)，檢測(cè)結(jié)果表明在AFP陽(yáng)性的HepG2肝癌細(xì)胞中Ad.AFPp-E1A、Ad.AFPep-E1A均有ElA蛋白表達(dá)，而在AFP陰性的chang liver正常肝細(xì)胞中，Ad.AFPp-E1A、Ad.AFPep-E1A均沒(méi)有檢測(cè)到ElA蛋白

6、表達(dá)；在感染了Ad.AFPep-E1A的HepG2細(xì)胞中E1A的表達(dá)量明顯高于感染了Ad.AFPp-E1A的HepG2細(xì)胞。⑶Ad.AFPp-E1A、Ad.AFPep-E1A感染人肝癌細(xì)胞（HepG2和Hep3B），人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞（NCIH460），以及正常肝細(xì)胞（chang liver細(xì)胞）后，通過(guò)病毒增殖測(cè)試實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Ad.AFPp-E1A及Ad. AFPep-E1A在人肝癌HepG2、Hep3B細(xì)胞中的復(fù)制能力明顯高于在非肝癌來(lái)

7、源的腫瘤細(xì)胞（NCIH460）及正常肝細(xì)胞中的復(fù)制能力。⑷通過(guò)細(xì)胞病變實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Ad.AFPp-E1A和Ad.AFPep-E1A對(duì)AFP陽(yáng)性細(xì)胞均具有一定的溶瘤作用，其中后者的溶瘤作用更為明顯。⑸通過(guò)細(xì)胞殺傷實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，感染了Ad.AFPp-E1A的HepG2、Hep3B細(xì)胞的存活率分別為(54.23±7.13)％、(61.18±12.63)％；而感染了Ad.AFPep-E1A后的HepG2、Hep3B細(xì)胞的存活率分別為(26.65±5.4

8、3)％、(24.49±3.31)％。與正常肝細(xì)胞對(duì)照相比，感染了Ad.AFPp-E1A、Ad.AFPep-E1A的肝癌細(xì)胞其生長(zhǎng)明顯受到抑制，其中Ad.AFPep-E1A抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的作用更為明顯。⑹通過(guò)Western blotting、病毒增殖測(cè)試證明帶有自殺基因TK的腺病毒載體Ad. AFPep-E1A-CMV-TK具有在AFP陽(yáng)性細(xì)胞中選擇性復(fù)制的能力，通過(guò)細(xì)胞病變實(shí)驗(yàn)證明該病毒自身具有一定的溶瘤作用。⑺Ad. AFPep-E1A

9、-CMV-TK聯(lián)合GCV后對(duì)AFP陽(yáng)性的HepG2和Hep3B肝癌細(xì)胞的殺傷作用增強(qiáng)。以非復(fù)制型腺病毒Ad.GFP作為對(duì)照，單獨(dú)使用Ad. AFPep-E1A-CMV-TK、以及Ad.AFPep-E1A-CMV-TK聯(lián)合GCV后HepG2、Hep3B細(xì)胞的存活率如下：HepG2細(xì)胞分別為(99.11±5.94)％、(25.56±1.23)％、(10.35±1.07)％；Hep3B細(xì)胞分別為(97.29±5.32)％、(24.54±7.3

10、0)％、(15.49±5.80)％。 結(jié)論：采用AFP基因啟動(dòng)子及截短了的AFP基因增強(qiáng)子順序作為調(diào)控元件，調(diào)控腺病毒復(fù)制所需的早期基因E1A表達(dá)，成功構(gòu)建了肝癌選擇性復(fù)制型腺病毒載體。與其他研究工作相比，我們所構(gòu)建的AFP人工啟動(dòng)子具有良好的肝癌選擇性，并為腺病毒載體插入治療基因提供了更多的空間；本研究不拘泥于單一的病毒療法，還在復(fù)制型腺病毒中加入了TK自殺基因，有機(jī)結(jié)合了復(fù)制型腺病毒的溶瘤作用與自殺基因的基因治療作用，這種協(xié)