荷載管家基因shRNA的雙調(diào)控溶瘤腺病毒的構(gòu)建及其體外抑制腎癌生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的:構(gòu)建hTERT啟動(dòng)子、E1855kD缺失雙調(diào)控并荷載管家基因GAPDH小發(fā)夾RNA的溶瘤腺病毒,并初步研究其對(duì)腎癌治療的作用,為溶瘤腺病毒進(jìn)一步荷載癌基因的shRNA奠定基礎(chǔ),同時(shí)為腫瘤的治療提供新的思路。
　　 方法:
　　 1.質(zhì)粒pTD55、pTD-GAPDH、pBHGE3的大量制備及酶切鑒定。
　　 2.同源重組法構(gòu)建條件增殖性腺病毒TD-GAPDH。
　　 3.小量擴(kuò)增提取重組腺病毒DNA

2、,PCR鑒定條件增殖腺病毒TD-GAPDH。
　　 4.鑒定正確后大量擴(kuò)增,純化,測(cè)滴度。
　　 5.Western blot法、免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)TD-GAPDH E1A蛋白的表達(dá)。
　　 6.通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄.聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)檢測(cè)GAPDH基因rnRNA表達(dá)情況。
　　 7.熒光顯微鏡、結(jié)晶紫染色法觀察TD-GAPDH對(duì)腎癌細(xì)胞毒性作用。
　　 8.MTT法檢測(cè)TD-GAPDH對(duì)腎癌細(xì)胞

3、OSRC、7860增殖的影響。
　　 9.TNUEL法檢測(cè)TD-GAPDH誘導(dǎo)腎癌細(xì)胞OSRC及7860的凋亡情況。
　　 結(jié)果:
　　 1.酶切鑒定質(zhì)粒pTD55、pTD-GAPDH、pBHGE3正確。
　　 2.PCR鑒定表明TD-GAPDH包含目的基因,且無(wú)野生型腺病毒污染,病毒構(gòu)建成功,滴度為3.5×10w PFU/ml。
　　 3.10MOI、48h處理?xiàng)l件下,蛋白印跡法(Western

4、 blot)、免疫細(xì)胞化學(xué)法顯示:TD-GAPDH處理組在腎癌細(xì)胞OSRC及7860均可以檢測(cè)到E1A的表達(dá),表明TD-GAPDH可在腎癌細(xì)胞中增殖。
　　 4.10MOI、48h處理?xiàng)l件下,RT-PCR檢測(cè):與對(duì)照組相比TD-GAPDH、TD55、ZD55-EGFP處理組在腎癌細(xì)胞OSRC及7860中GAPDH mRNA表達(dá)均降低:OSRC細(xì)胞為(36.9±4.89)％vs(61.0±2.15)％vs(68.3±1.28)％,

5、7860細(xì)胞為(46.6±1.70)％vs(74.9±1.47)％vs(80.0±4.15),GAPDH mRNA表達(dá)量依次為ZD55-EGFP＞TD55＞TD-GAPDH,TD-GAPDH組與其它各組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 5.細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果:TD-GAPDH、TD55與ZD55-EGFP感染腎癌細(xì)胞OSRC及78605天后對(duì)腎癌細(xì)胞OSRC及7860均有殺傷作用,細(xì)胞毒性依次為TD-GAPDH＞TD55＞ZD55-

6、EGFP。6.用MOI=10的TD-GAPDH、TD55與ZD55.EGFP感染腎癌細(xì)胞OSRC、7860細(xì)胞,4天后存活率各病毒依次為:OSRC為(26.1±2.98)％vs(47.2±3.10)％vs(61.2±2.52)％vs PBS,7860為(34.1±2.63)％)vs(43.0±2.28)％vs(65.2±2.94)％vs PBS。三種病毒對(duì)腎癌細(xì)胞OSRC、7860增殖均有抑制作用,并且存在濃度及時(shí)間依賴性,TD55-G

7、APDH抑制腎癌細(xì)胞增殖作用最強(qiáng)。各組間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 7.TD-GAPDH增加外源基因的表達(dá):感染腎癌細(xì)胞OSRC及7860,1天后,TD-GAPDH在感染的腎癌細(xì)胞中都只有很弱的熒光蛋白表達(dá)。3天后,TD-GAPDH處理組感染的腎癌細(xì)胞中大多出現(xiàn)了明顯的細(xì)胞病變且熒光蛋白表達(dá)量顯著增加,但在腎癌細(xì)胞7860中熒光蛋白表達(dá)量略低于OSRC細(xì)胞;ZD55.EGFP、TD-GAPDH感染腎小管上皮細(xì)胞HK-2,3天

8、后ZD55-EGFP處理組熒光蛋白少量表達(dá),TD-GAPDH處理組則不表達(dá)。
　　 8.TUNEL凋亡:TD-GAPDH、TD55、ZD55-EGFP感染腎癌細(xì)胞后與對(duì)照組相比各組凋亡細(xì)胞陽(yáng)性率為:OSRC為(49.4±5.81)％vs(36.0±2.38)％vs(21.7±1.89)％;7860為(48.0±3.17)％vs(32.3±6.68)％vs(23.6±5.43)％,不同病毒處理組誘導(dǎo)OSRC、7860細(xì)胞凋亡能力依

9、次TD-GAPDH＞TD55＞ZD55-EGFP。各組之間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)論:
　　 1.成功構(gòu)建hTERT啟動(dòng)子、E1855kD缺失雙調(diào)控并荷載管家基因GAPDH小發(fā)夾RNA的溶瘤腺病毒TD-GAPDH;
　　 2.TD-GAPDH能在腎癌細(xì)胞內(nèi)特異性復(fù)制,對(duì)腎癌有高度靶向性作用。另外,TD-GAPDH能特異性沉默GAPDH基因,具有抑制腫瘤細(xì)胞的增殖,促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡作用,為溶瘤腺病毒進(jìn)一步荷載