ndrg2兩亞型重組腺病毒的構(gòu)建及其抑制人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系生長(zhǎng)的研究.pdf

1、膠質(zhì)瘤是神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤，具有高發(fā)病率，高致殘率和高死亡率，目前其臨床治療效果卻難以令人滿(mǎn)意。癌基因的激活和（或）抑癌基因的失活是膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過(guò)程最基本的分子事件。因而基因治療在膠質(zhì)瘤的治療極有前途。運(yùn)用抑癌基因轉(zhuǎn)移到病人體內(nèi)以增強(qiáng)人體抗瘤能力或促使瘤體消亡又是基因治療的首選。
　　人ndrg2基因是鄧艷春教授用消減雜交法從人腦組織中克隆得到的一個(gè)新基因，已登陸到基因庫(kù)（登錄號(hào)AF159092）。ndrg2是多種腫瘤組

2、織與相應(yīng)正常組織的差異表達(dá)基因，在腦、骨骼肌和唾液腺中高表達(dá);在肝、胃腸道上皮和肺上皮中中等表達(dá)；在胸腺、骨髓和睪丸中低表達(dá)。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的組織標(biāo)本和細(xì)胞系中，可發(fā)現(xiàn)ndrg2的表達(dá)降低。同時(shí)ndrg2在膠質(zhì)瘤中過(guò)表達(dá)時(shí)，可抑制細(xì)胞增殖，同時(shí)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的G1期阻滯ndrg2經(jīng)研究證實(shí)有ndrg2S和ndrg2L兩種亞型。ndrg2S全長(zhǎng)為2024bp，編碼357個(gè)氨基酸；ndrg2L全長(zhǎng)為2066bp，編碼371個(gè)氨基酸。既往我們的研

3、究多集中于ndrg2短基因（ndrg2S)上，而研究方法多采用免疫組化、RT-PCR和基因轉(zhuǎn)染。由于ndrg2的長(zhǎng)基因和短基因的編碼區(qū)只相差42bp的核苷酸即14個(gè)氨基酸的序列，核苷酸序列的高度一致性和蛋白質(zhì)抗原的相似性，使得在上述結(jié)果中不能區(qū)分開(kāi)是ndrg2的長(zhǎng)基因或短基因的作用，基因轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)也只證明了ndrg2的短基因抗腫瘤作用，從來(lái)沒(méi)有人證明ndrg2長(zhǎng)基因是否具有相同的抗腫瘤作用。
　　腺病毒是無(wú)包膜的線性雙鏈DNA病毒，

4、在自然界廣泛分布，對(duì)人致病性小，不誘導(dǎo)癌變，較為安全，不整合入細(xì)胞基因組，遺傳毒性低，宿主范圍廣，轉(zhuǎn)染效率高，易于制備，純化。腺病毒載體多用于基因表達(dá)，轉(zhuǎn)移和治療。轉(zhuǎn)基因效率高，容易制得高滴度病毒載體，全性高，進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)并不整合到宿主細(xì)胞基因組，僅瞬時(shí)表達(dá)。目前已有含有ndrg2S的重組病毒構(gòu)建成功。
　　為了深入研究ndrg2基因的功能，明確ndrg2L對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用及其機(jī)制，為探索ndrg2的抗腫瘤機(jī)制，同時(shí)為進(jìn)一步探索膠

5、質(zhì)瘤發(fā)病機(jī)制和新的治療策略，本課題組擬建立ndrg2長(zhǎng)短兩種亞型的重組腺病毒，并利用其感染人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系后進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)，今后進(jìn)一步對(duì)該基因進(jìn)行深入研究。
　　首先，采用腺病毒表達(dá)系統(tǒng)Vira Power TM Adenoviral Expression System構(gòu)建腺病毒載體。首先將ndrg2兩種亞型（長(zhǎng)短2種亞型分別命名為ndrg2L，ndrg2S）利用酶切、連接、轉(zhuǎn)化、擴(kuò)增后提取質(zhì)粒等方法克隆入入門(mén)載體pENTR2

6、B以獲得入門(mén)克隆pENTR2B-ndrg2L，pENTR2B-ndrg2S，雙酶切及PCR鑒定正確后，用重組酶LR Clonase TM II Enzyme Mix進(jìn)行入門(mén)克隆與表達(dá)載體pAd-CMV/V5-DEST間的重組反應(yīng)以獲得表達(dá)克隆pAd-CMV/V5-DEST-ndrg2L和pAd-CMV/V5-DEST-ndrg2S的質(zhì)粒。表達(dá)克隆經(jīng)PCR鑒定后用限制性?xún)?nèi)切酶PacI線性化后轉(zhuǎn)染HEK293A包裝細(xì)胞得到重組腺病毒（分別命

7、名為Ad-ndrg2L和Ad-ndrg2S），經(jīng)過(guò)反復(fù)的感染擴(kuò)增后，用半數(shù)組織培養(yǎng)感染劑量法（Tissue culture infective dose 50，TCID50）檢測(cè)病毒滴度，用Western Blot檢測(cè)重組病毒載體是否能正確表達(dá)ndrg2蛋白。結(jié)果成功構(gòu)建了ndrg2基因長(zhǎng)短2種亞型的重組腺病毒載體，并包裝擴(kuò)增病毒，可為腫瘤基因治療的研究提供依據(jù)。
　　為了探知ndrg2新的變異型(ndrg2L)是否具有抗腫瘤作用

8、，如有作用，ndrg2基因長(zhǎng)短兩種亞型抗腫瘤作用又有無(wú)差異？本實(shí)驗(yàn)還采用了流式細(xì)胞術(shù)，MTT法，平板克隆形成實(shí)驗(yàn)的方法對(duì)用ndrg2基因長(zhǎng)短兩種亞型腺病毒感染后的膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行了檢測(cè)?？梢钥吹剑豪昧魇郊?xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期，感染ndrg2兩亞型腺病毒的膠質(zhì)瘤細(xì)胞處于G1期的細(xì)胞數(shù)，多于感染EGFP病毒和未感染病毒的膠質(zhì)瘤細(xì)胞G1期細(xì)胞數(shù)。MTT實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明：感染ndrg2兩亞型腺病毒的膠質(zhì)瘤細(xì)胞，與感染EGFP病毒和未感染病毒的膠質(zhì)瘤細(xì)