抑制人cFLIP基因表達(dá)的shRNA腺病毒的構(gòu)建與功能驗(yàn)證.pdf

1、中文摘要抑制人cFLIP基因表達(dá)的shRNA腺病毒的構(gòu)建與功能驗(yàn)證中文摘要[目的】：構(gòu)建能高效特異性抑制人原發(fā)性肝癌細(xì)胞中eFLIP基因表達(dá)的腺病毒載體；測(cè)定HepG2細(xì)胞中腺病毒載體轉(zhuǎn)染的效率；檢測(cè)shRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞cFLIP蛋白表達(dá)的情況；觀察腺病毒eFLIPshRNA對(duì)細(xì)胞增殖的影響。I方法l：1根據(jù)人cFLIPmRNA的序列，設(shè)計(jì)合成4對(duì)cFLIP基因的shRNA，將其連入干擾載體，轉(zhuǎn)染HepG2，采用RTPCR和蛋白印跡法評(píng)

2、價(jià)基因表達(dá)情況。2利用上述mRNA合成單鏈目的片段，取互補(bǔ)的2條單鏈寡核苷酸進(jìn)行連接反應(yīng)，根據(jù)篩選出得最佳干擾片段，構(gòu)建腺病毒表達(dá)載體。3將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞后，將篩選獲得的最佳cFLIPshRNA片段進(jìn)行雙酶切，片段回收后連接、轉(zhuǎn)化，酶切鑒定。篩選出陽(yáng)性克隆，磷酸鈣法轉(zhuǎn)染293細(xì)胞，通過(guò)包裝、擴(kuò)增和純化，獲得重組腺病毒Ad5shcFLIP，設(shè)置對(duì)照組，并進(jìn)行病毒滴度測(cè)定。MTT檢測(cè)對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2的抑制率?！窘Y(jié)果1l1cF

3、LIP在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)：利用RealtimePCR檢測(cè)cFLIP在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)，結(jié)果顯示，cFLIP在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)。2重組質(zhì)粒酶切及測(cè)序鑒定結(jié)果：經(jīng)HindIII和BamHI線性化的質(zhì)粒pGenesil1與合成的shRNA片段進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、質(zhì)粒提取后，經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶HindIII和SalI雙酶切鑒定分析后，l％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，獲得陽(yáng)性質(zhì)粒，陽(yáng)性質(zhì)粒送公司測(cè)序，結(jié)果完全符合設(shè)計(jì)要求。3細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率觀察：經(jīng)Lipofecta

4、mineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法轉(zhuǎn)染48h后，用倒置熒光顯微鏡觀察HepG2細(xì)胞中綠色熒光蛋白報(bào)告基因的表達(dá)，以檢測(cè)轉(zhuǎn)染效率。熒光結(jié)果顯示48h時(shí)HepG2細(xì)胞均有較強(qiáng)熒光表達(dá)，其轉(zhuǎn)染率約為70％。4shRNA轉(zhuǎn)染后細(xì)胞eFLIP蛋白表達(dá)的檢測(cè)：相同質(zhì)量的shRNA載體應(yīng)用脂質(zhì)體2000法轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞(shRNAl、shRNA2、shRNA3，shRNA4，shRNAC)，作用48h后進(jìn)行Westernblotting分析。結(jié)果顯

5、示4對(duì)shRNA對(duì)cFLIP蛋白表達(dá)均有不同程度的抑制作用，其中抑制作用最強(qiáng)的是shRNA2。5腺病毒eFLIPshRNA的純化與干擾效果檢測(cè)：經(jīng)過(guò)載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)染、包裝、純化獲得表達(dá)cFLIPshRNA的腺病毒，獲得了特異性抑制肝癌細(xì)胞中cFLIP表達(dá)的腺病毒。6腺病毒cFLIPshRNA對(duì)細(xì)胞增殖的影響：利用MTT方法，檢測(cè)其對(duì)HepG2細(xì)胞增殖的影響，結(jié)果顯示表達(dá)cFLIPshRNA的腺病毒感染的Hel)132細(xì)胞增殖能力較未感染c

6、FLIPshRNA的腺病毒的HepG2細(xì)胞明顯下降。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組具有顯著的差異，且二者比較差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義口005)。l結(jié)論1：1凋亡抑制蛋白cFLIP在肝癌細(xì)胞中高表達(dá)。2利用線性化質(zhì)粒與合成的shRNA片段連接、轉(zhuǎn)化、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后成功構(gòu)建能特異且高效阻斷eFLIP表一英文摘要ConstructionandfunctionalidentificationofadenoviralshRNAsuppressinghumancFLIPex

7、pressionAbstractobjectives：Toc0碰mllctadenoviralvectorforspeciallyinhibitingthecFLWexpression，detectthetransfectedefficiencyofadenovirusvectorinHepG2cells，determinatetheproteinexpressionofcFLIPshRNAinthetransfectedcellsan

8、dtheeffectoncellproliferationofcFLIPshRNAofAdenovirusMethods：1AccordingthesequenceofcFLIPm_gNAwedesignedandsynthesizedfourpairsofcFLIPgeneshRNAWeconnectedthecFLIPshRNAtotheinterferencevectorandtransfectedHepG2，analysisth

9、egeneexpressionbyRTPCRandWesternblotting2Us崦oftheabovemRNAsinglestrandedtargetfragmentwemadeligation、析tlltwocomplementarysinglestrandedoligonucleotideandbuildedadenovirusexpressionvectorwiththeBestinterferencefiagmenL3We

10、transfectedtherecombinantplasmidsintoHepG2cellsanddoubledigestedthebestcFLIPshRNAfragmentsAfterligationtransformationrestrictionendonucleasedigestionwedetectedthecFLIPshRNAfragmentsThepositiveclonesweretransfectedintothe

11、293cellsbycalciumphosphatemethodandtherecombinantadenovirusAdSshcFLIPwereobtainedafterpackaging，amplificationandpurificationSettingthecontrolgroup，wedeterminedthevirustiterTheinhibitionrateofHepG2cellswasdetectedby^蕾rrRe

12、sults：1cFLIPexpressionintumorcells：RealtimePCRwaguedtodetecttheexpressionofcFLWinvarioustumorcells；theresultsshowedthatcFLIPinliverC—allCercellspresentahighlevelofexpression2Resultsofrecombinantplasmidrestrictionenzymedi

13、gestionandsequencingidentification：AfterlinearizedbyHindIIIandBamHI，plasmidpGenesil一1wasligatedwithfragmentssynthesisofshRNATheproductWastransformedandculturedinLBmediumAfterplasmidextractionnewplasmidWasgotThenewplasmid

14、WasidentifiedbyrestrictionenzymeSailrestrictionenzymedigestionanddetectedbyelectrophoresisin1％agarosegelPositiveplasmidswereobtainedwhichwerenamedpGeneSilcFLIP1，pGeneSileFLIP一2，pGeneSilcFLIP3，pGeneSileFLIP4，pGeneSilcontr