選擇性封閉腫瘤STAT3的新型溶瘤腺病毒M3的構建及應用.pdf

1、第一部分
　　 目的：本實驗室的第一代腺病毒載體(Ad5/dE1/TK)不能復制，體內存在時間短；第二代腺病毒載體(Ad5/dE1A/6.7K/gp19K)能復制，有一定的選擇性，病毒裂解腫瘤細胞釋放的腫瘤抗原可激發(fā)機體的特異性免役反應，對正常細胞有一定的毒性；針對以上兩種腺病毒載體缺點，本課題構建一種具有更高腫瘤特異性的新型溶瘤腺病毒基因治療載體(Ad5/dE1A/ADP)，并將該載體和癌癥治療的一個理想靶點相結合-命名為M3

2、，使之具有更高的選擇性復制能力、病毒擴增量大、高效表達靶基因、有一定程度的免疫逃避能力和對正常細胞幾無毒性的特點，具有強大的腫瘤特異性殺傷效應，為腫瘤的治療提供了一個強有力的工具。
　　 方法：應用層析技術獲取腺病毒的TP-DNA，二次PCR 技術對Ad5基因組E3 區(qū)的ADP基因進行定點缺失，通過限制酶消化、連接酶連接、轉化、克隆、體外同源重組、鈣磷轉染、細胞病毒內包裝、腺病毒單克隆純化等技術獲得重組腺病毒，通過PCR擴增、測

3、序技術對該重組腺病毒進行鑒定。CsCl梯度液超速離心獲得純化的重組腺病毒。
　　 結果：成功的獲得了具有高包裝效率的腺病毒TP-DNA，通過該TP-DNA和穿梭載體的同源重組獲得了正確的重組腺病毒。
　　 結論：獲得的重組腺病毒基因治療載體M3具有預想的各種技術特征，為研究該載體的應用價值奠定了基礎。
　　 第二部分
　　 目的：對已構建成功的這種具有更高腫瘤特異性的新型溶瘤腺病毒載體M3的基本生物學特性

4、進行鑒定，判斷該載體是否滿足本課題最初的設想。
　　 方法：應用PCR檢測該載體攜帶的外源基因(反義STAT3 cDNA片段)的表達模式，外源基因的表達是否模擬了被替代的腺病毒基因(ADP)的表達模式；real-time PCR檢測ADP基因的缺失或反義STAT3 cDNA片段的插入對E3區(qū)其它基因表達的影響；CPE實驗檢測該載體對不同腫瘤細胞和正常細胞的裂解能力；病毒爆發(fā)實驗及TCID50檢測ADP基因的缺失或反義STAT3

5、cDNA片段的插入對子代病毒產量的影響。
　　 結果：M3所攜帶外源基因主要在病毒復制的晚期表達，且其表達依賴于病毒DNA的復制，與被替代的腺病毒基因(ADP)的表達模式相一致；ADP基因的缺失或反義STAT3 cDNA片段的插入對其周圍E3區(qū)的其它基因沒有產生顯著的影響；M3在腫瘤細胞種引起的CPE效應遲于相應的野生型病毒，5000倍于野生型腺病毒感染量時亦未在正常的細胞中觀察到明顯的CPE效應；ADP基因的缺失使得腫瘤細胞內

6、子代病毒的量顯著增加。
　　 結論：獲得的重組腺病毒M3具有預想的各種基本生物學特性，為該載體的應用奠定了基礎。
　　 第三部分
　　 目的：驗證M3對靶蛋白的封閉效應、體外對腫瘤細胞表型的影響和體內的溶瘤效應。
　　 方法：Western blot免疫印跡和real-time PCR檢測M3對靶蛋白的封閉及其下游效應蛋白的調節(jié)；應用流式細胞分析技術檢測M3在體外對不同組織來源的腫瘤細胞的殺傷能力；耐藥細

7、胞株的應用檢測M3的化療增敏作用；Transwell體外侵襲實驗觀察M3對不同腫瘤細胞侵襲能力的影響；異位及原位腫瘤移植模型檢測M3的體內治療效應。
　　 結果：Western blot結果表明M3可有效抑制腫瘤細胞內靶蛋白STAT3的表達并下調其下游蛋白c-myc、Bcl-xL、survivin、VEGF、MMP-9和Tim3的表達，但對正常細胞HUVEC內的STAT3的表達沒有影響；流式分析結果顯示與Ad5/dE1A及Ad5

8、/dE1A/ADP相比，M3對不同組織來源的腫瘤細胞具有強大的殺傷力，腫瘤細胞的最大凋亡率可達80％以上，顯著增強了卵巢癌耐藥細胞系C13K對藥物的敏感性；體外侵襲實驗表明M3可顯著抑制腫瘤細胞的侵襲能力；前列腺癌及胃癌皮下移植瘤動物模型的實驗結果表明瘤內直接注射M3可顯著抑制腫瘤的生長，胃癌原位移植模型的實驗結果表明，經靜脈注射病毒不僅可顯著抑制腫瘤的生長，同時亦顯著的抑制了胃癌細胞的腹腔種植性轉移。
　　 結論：重組腺病毒M