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文檔簡介
1、第一部分
目的:本實(shí)驗(yàn)室的第一代腺病毒載體(Ad5/dE1/TK)不能復(fù)制,體內(nèi)存在時(shí)間短;第二代腺病毒載體(Ad5/dE1A/6.7K/gp19K)能復(fù)制,有一定的選擇性,病毒裂解腫瘤細(xì)胞釋放的腫瘤抗原可激發(fā)機(jī)體的特異性免役反應(yīng),對(duì)正常細(xì)胞有一定的毒性;針對(duì)以上兩種腺病毒載體缺點(diǎn),本課題構(gòu)建一種具有更高腫瘤特異性的新型溶瘤腺病毒基因治療載體(Ad5/dE1A/ADP),并將該載體和癌癥治療的一個(gè)理想靶點(diǎn)相結(jié)合-命名為M3
2、,使之具有更高的選擇性復(fù)制能力、病毒擴(kuò)增量大、高效表達(dá)靶基因、有一定程度的免疫逃避能力和對(duì)正常細(xì)胞幾無毒性的特點(diǎn),具有強(qiáng)大的腫瘤特異性殺傷效應(yīng),為腫瘤的治療提供了一個(gè)強(qiáng)有力的工具。
方法:應(yīng)用層析技術(shù)獲取腺病毒的TP-DNA,二次PCR 技術(shù)對(duì)Ad5基因組E3 區(qū)的ADP基因進(jìn)行定點(diǎn)缺失,通過限制酶消化、連接酶連接、轉(zhuǎn)化、克隆、體外同源重組、鈣磷轉(zhuǎn)染、細(xì)胞病毒內(nèi)包裝、腺病毒單克隆純化等技術(shù)獲得重組腺病毒,通過PCR擴(kuò)增、測
3、序技術(shù)對(duì)該重組腺病毒進(jìn)行鑒定。CsCl梯度液超速離心獲得純化的重組腺病毒。
結(jié)果:成功的獲得了具有高包裝效率的腺病毒TP-DNA,通過該TP-DNA和穿梭載體的同源重組獲得了正確的重組腺病毒。
結(jié)論:獲得的重組腺病毒基因治療載體M3具有預(yù)想的各種技術(shù)特征,為研究該載體的應(yīng)用價(jià)值奠定了基礎(chǔ)。
第二部分
目的:對(duì)已構(gòu)建成功的這種具有更高腫瘤特異性的新型溶瘤腺病毒載體M3的基本生物學(xué)特性
4、進(jìn)行鑒定,判斷該載體是否滿足本課題最初的設(shè)想。
方法:應(yīng)用PCR檢測該載體攜帶的外源基因(反義STAT3 cDNA片段)的表達(dá)模式,外源基因的表達(dá)是否模擬了被替代的腺病毒基因(ADP)的表達(dá)模式;real-time PCR檢測ADP基因的缺失或反義STAT3 cDNA片段的插入對(duì)E3區(qū)其它基因表達(dá)的影響;CPE實(shí)驗(yàn)檢測該載體對(duì)不同腫瘤細(xì)胞和正常細(xì)胞的裂解能力;病毒爆發(fā)實(shí)驗(yàn)及TCID50檢測ADP基因的缺失或反義STAT3
5、cDNA片段的插入對(duì)子代病毒產(chǎn)量的影響。
結(jié)果:M3所攜帶外源基因主要在病毒復(fù)制的晚期表達(dá),且其表達(dá)依賴于病毒DNA的復(fù)制,與被替代的腺病毒基因(ADP)的表達(dá)模式相一致;ADP基因的缺失或反義STAT3 cDNA片段的插入對(duì)其周圍E3區(qū)的其它基因沒有產(chǎn)生顯著的影響;M3在腫瘤細(xì)胞種引起的CPE效應(yīng)遲于相應(yīng)的野生型病毒,5000倍于野生型腺病毒感染量時(shí)亦未在正常的細(xì)胞中觀察到明顯的CPE效應(yīng);ADP基因的缺失使得腫瘤細(xì)胞內(nèi)
6、子代病毒的量顯著增加。
結(jié)論:獲得的重組腺病毒M3具有預(yù)想的各種基本生物學(xué)特性,為該載體的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
第三部分
目的:驗(yàn)證M3對(duì)靶蛋白的封閉效應(yīng)、體外對(duì)腫瘤細(xì)胞表型的影響和體內(nèi)的溶瘤效應(yīng)。
方法:Western blot免疫印跡和real-time PCR檢測M3對(duì)靶蛋白的封閉及其下游效應(yīng)蛋白的調(diào)節(jié);應(yīng)用流式細(xì)胞分析技術(shù)檢測M3在體外對(duì)不同組織來源的腫瘤細(xì)胞的殺傷能力;耐藥細(xì)
7、胞株的應(yīng)用檢測M3的化療增敏作用;Transwell體外侵襲實(shí)驗(yàn)觀察M3對(duì)不同腫瘤細(xì)胞侵襲能力的影響;異位及原位腫瘤移植模型檢測M3的體內(nèi)治療效應(yīng)。
結(jié)果:Western blot結(jié)果表明M3可有效抑制腫瘤細(xì)胞內(nèi)靶蛋白STAT3的表達(dá)并下調(diào)其下游蛋白c-myc、Bcl-xL、survivin、VEGF、MMP-9和Tim3的表達(dá),但對(duì)正常細(xì)胞HUVEC內(nèi)的STAT3的表達(dá)沒有影響;流式分析結(jié)果顯示與Ad5/dE1A及Ad5
8、/dE1A/ADP相比,M3對(duì)不同組織來源的腫瘤細(xì)胞具有強(qiáng)大的殺傷力,腫瘤細(xì)胞的最大凋亡率可達(dá)80%以上,顯著增強(qiáng)了卵巢癌耐藥細(xì)胞系C13K對(duì)藥物的敏感性;體外侵襲實(shí)驗(yàn)表明M3可顯著抑制腫瘤細(xì)胞的侵襲能力;前列腺癌及胃癌皮下移植瘤動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明瘤內(nèi)直接注射M3可顯著抑制腫瘤的生長,胃癌原位移植模型的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)靜脈注射病毒不僅可顯著抑制腫瘤的生長,同時(shí)亦顯著的抑制了胃癌細(xì)胞的腹腔種植性轉(zhuǎn)移。
結(jié)論:重組腺病毒M
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