溶瘤病毒對結(jié)直腸腫瘤細胞的選擇性殺傷作用.pdf

1、[背景和目的]惡性腫瘤是人類最常見的死因之一,隨著診療技術(shù)的不斷提高,腫瘤患者的總體生存率有了顯著提高,但對于一部分腫瘤患者,如大腸癌、肺癌等,生存率的改善仍不明顯,需要進一步尋找新的治療方法.腫瘤生物治療是目前腫瘤治療的研究熱點之一,溶瘤病毒是利用突變病毒基因或利用腫瘤特異性啟動子控制病毒腫瘤特異性復(fù)制,進而達到選擇性殺傷腫瘤細胞的一類病毒.目前已用腫瘤特異性啟動子構(gòu)建了多種溶瘤病毒,但是由于在這些載體中運用了組織特異性的啟動子,它們

2、的抗腫瘤范圍被限制在特定種類的癌癥,不具廣譜抗腫瘤性.端粒酶是染色體末端復(fù)制時所需的一種酶,它在85﹪以上的腫瘤細胞中是活性增高的,而在絕大多數(shù)體細胞中是失活的,這提示端粒酶啟動子在腫瘤靶向性生物治療中具有良好的應(yīng)用價值.基于以上原理,構(gòu)建了hTERT啟動子驅(qū)動E1基因和GFP基因表達的腺病毒載體Ad/hTERT-GFP-E1,以達到腫瘤特異性復(fù)制和腫瘤靶向性治療的目的.在本實驗中將選用多種大腸癌細胞,通過測定細胞活力來檢驗該腺病毒載體

3、在體外的抗腫瘤作用,并探討其抗腫瘤的機制及進一步的應(yīng)用. [實驗方法]用293細胞擴增各重組腺病毒,通過氯化銫密度梯度離心法純化腺病毒;TCID<,50>法測定病毒滴度及其體外復(fù)制能力;熒光顯微鏡下觀察細胞GFP的表達;MTT法及細胞克隆形成試驗檢驗該病毒在體外對腫瘤細胞及正常細胞的殺傷作用;用原位細胞凋亡試劑盒對病毒感染后的細胞行凋亡檢測,各處理組間的差異采用配對的t檢驗來評估. [結(jié)果]1)腺病毒體外復(fù)制能力的測定:

4、用Ad/hTERT-GFP-E1及Ad/CMV-GFP感染DLD1細胞48h后,在光鏡下見Ad/hTERT-GFP-E1感染的DLD1細胞出現(xiàn)細胞病變效應(yīng)(CPE),在熒光顯微鏡下觀察到有明顯的GFP表達,感染了Ad/CMV-GFP的DLD1細胞中也可見GFP表達,但細胞形態(tài)無明顯變化,而感染這兩種病毒的正常人成纖維細胞(NHFB)細胞未見任何CPE且僅見極少量的GFP表達;一周后取以上細胞裂解液感染DLD1細胞,結(jié)果顯示用感染Ad/h

5、TERT-GFP-E1的DLD1裂解液再次感染48h后仍可見明顯的CPE及GFP表達,而其他的細胞裂解液均未造成類似的效果.對上述裂解液進行TCID50測定后結(jié)果表明DLD1細胞感染Ad/hFERT-GFP-E1的裂解液后病毒滴度明顯高于感染Ad/CMV-GFP的裂解液,而在NHFB細胞分別感染上述兩種病毒的裂解液后病毒滴度無明顯差異.2)溶瘤病毒對大腸癌細胞的體外殺傷作用:選擇不同滴度的病毒感染正常細胞(NHFB)及大腸癌細胞(DID

6、1、HCT8、LOVO、SWll6、HCT116),5天后MTT法測定其細胞活力,結(jié)果表明Ad/hTERT-GFP-E1對NHFB沒有殺傷作用,而對大腸癌細胞均有明顯的殺傷作用,而且殺傷作用與病毒濃度存在劑量依賴關(guān)系,Ad/CMV-GFP對以上腫瘤細胞都無明顯的抑制作用;用250MOI的兩種病毒分別感染LOVO和NHFB后,在第3、5、7、9天測定細胞活力,結(jié)果顯示Ad/hTERT-GFP-E1對LOVO的殺傷作用隨作用時間增加而增強,

7、而NHFB細胞的相對活力與感染時間不存在相關(guān)性;細胞克隆形成試驗結(jié)果也顯示Ad/hTERT-GFP-E1能夠顯著抑制腫瘤細胞克隆形成,該抑制作用存在劑量依賴關(guān)系.3)、凋亡檢測:分別用500MOI的Ad/htERT-GFP-E1及Ad/CMV-GFP感染DLD1細胞48小時后用原位細胞凋亡試劑盒進行凋亡檢測,結(jié)果顯示Ad/hTERT-GFP-E1作用后細胞凋亡率較Ad/CMV-GFP及PBS處理后明顯增加,細胞計數(shù)后的結(jié)果顯示:PBS組

8、、Ad/CMV-GFP組、Ad/hTERT-GFP-E1組的凋亡率為分別為1.44±0.15﹪、1.75±0.47﹪、10.75±1.24﹪,Ad/hTERT-GFP-E1所引起的凋亡率顯著高于其他兩個對照組. [結(jié)論]1)溶瘤腺病毒Ad/hTERT-GFP-E1能夠選擇性地在腫瘤細胞內(nèi)復(fù)制,并且能夠在長時間內(nèi)維持較高的病毒滴度;2)Ad/hTERT-GFP-E1能夠選擇性地殺傷腫瘤細胞,而對人正常纖維細胞都沒有毒性作用;3)溶