阿司匹林選擇性清除結直腸癌干細胞及其分子調控機制研究.pdf

1、研究背景：
　　結直腸癌為常見多發(fā)的惡性腫瘤，據(jù)報告全美國2012年結直腸癌新發(fā)病例數(shù)及死亡病例數(shù)均居全部惡性腫瘤的第3位。盡管我國結直腸癌基礎研究與早期干預有較大進步，但其發(fā)病率與死亡率仍呈明顯上升趨勢，日益成為嚴重危害人類健康的重要疾病。已有研究證明結直腸癌等惡性腫瘤中存在腫瘤干細胞(CancerStem Cell; CSC)，CSC是一群具有很強的自我更新能力和多向分化潛能的細胞，雖在腫瘤細胞中所占比例很小，但在腫瘤發(fā)生，治

2、療抵抗，復發(fā)轉移中起著重要的作用。因此治療結直腸癌關鍵在于清除結直腸癌干細胞(Colorectal Cancer StemCell，CCSC)。
　　小分子化合物阿司匹林(Aspirin)是世界上使用最多，使用時間最長，且不會產(chǎn)生藥物依賴性的非甾體抗炎藥。流行病學和臨床實驗表明，Aspirin除了用于解熱、抗血小板凝聚等，還可防治包括結直腸癌、食道癌、肺癌在內(nèi)的多種腫瘤。大量證據(jù)也表明阿司匹林能夠明顯降低結直腸癌發(fā)生率和死亡率、改

3、善患者預后，但其作用機制不明。最近有文獻報道非甾體抗炎藥（吲哚美辛）能夠降低結直腸癌細胞系中CCSC的數(shù)量。但是，Aspirin是否能抑制CCSC及其具體的分子調控機制尚未見報道。
　　因此，深入研究Aspirin對CCSC效應有助于拓展Aspirin的臨床應用，可為篩選結直腸癌治療的潛在分子靶點、設計更加高效抗腫瘤藥物提供理論基礎，具有重要的臨床意義，是當前迫切需要探索和解決的重要科學前沿問題。
　　研究方法：
　　

4、利用無血清培養(yǎng)體系從原代結直腸癌細胞及ATCC標準細胞系中富集CCSC，并對其生物學特性（克隆球形成能力，耐藥性，成瘤性，腫瘤干細胞比例，干性基因表達水平）等進行鑒定。在培養(yǎng)體系中加入不同濃度梯度的Aspirin，比較處理前后CCSC生物學特性的改變。利用MTS實驗檢測Aspirin對CCSC的殺傷效應是否具有選擇性，并免疫熒光和流式細胞術分析其通過何種方式（凋亡/自噬）選擇性抑制CCSC。還利用定量PCR檢測CCSC和non-CCSC

5、中凋亡相關基因表達水平，篩選Aspirin通過何種凋亡因子誘導細胞凋亡，進一步采用封閉性抗體抑制相關通路后檢測Aspirin對CCSC的影響。同時還應用染色質免疫沉淀技術從表觀遺傳學角度探討了該凋亡因子的上游調控機制。
　　研究結果：
　　1.利用無血清培養(yǎng)技術富集的CCSC具有典型的腫瘤干細胞特性，Aspirin能抑制CCSC的腫瘤干細胞特性。
　　利用無血清培養(yǎng)體系從原代結直腸癌細胞及ATCC標準細胞系HT29中成

6、功富集了CCSC，與non-CCSC比較，CCSC克隆球形成能力明顯加強，干性基因(Sox2，Oct4，Nanog，Notch1，Bmi-1和ALDH1)的表達水平明顯升高，干細胞標記ALDH1的表達水平明顯增高，對化療藥物奧沙利鉑(OXA)的耐藥性明顯增加，體內(nèi)成瘤性也明顯增強。CCSC中加入不同濃度梯度的Aspirin(0，2.5，5.0，10.0mM)，與對照組比較，Aspirin能抑制克隆球的數(shù)量和減少其直徑，降低干性基因(So

7、x2，Oct4，Nanog，Notch1，Bmi-1和ALDH1)的表達水平以及干細胞標記ALDH1的表達水平，增加CCSC對OXA的敏感性，且這些效應呈明顯的劑量依賴性。體內(nèi)成瘤實驗也表明Aspirin能抑制CCSC的生長，降低其成瘤體積。這些結果證實在Aspirin能明顯地抑制CCSC干細胞特性。
　　2.Aspirin通過上調FasL選擇性誘導CCSC凋亡。
　　既然Aspirin能明顯地抑制CCSC，那么Aspiri

8、n對CCSC和non-CCSC的抑制作用是否存在著差異？我們的研究證實Aspirin選擇性抑制了CCSC。目前的研究報道Aspirin主要是通過誘導凋亡或自噬抑制腫瘤細胞，我們的結果發(fā)現(xiàn)Aspirin選擇性地誘導了CCSC的凋亡而不是自噬。凋亡分為外源性凋亡途徑和內(nèi)源性凋亡途徑，我們的研究證實Aspirin上調CCSC中的FasL，通過外源性的凋亡途徑介導其凋亡。而在non-CCSC中FasL，F(xiàn)as均出現(xiàn)下調，因此選擇性地誘導了CCS

9、C的凋亡。并且利用封閉性抗體封閉FasL后，CCSC的存活率明顯增加，凋亡細胞明顯減少。
　　3.Aspirin通過非COX-2途徑上調FasL.
　　Aspirin抗結直腸癌的經(jīng)典機制是認為Aspirin降低了COX-2的酶活性進而影響了PGE2的合成，我們的研究證實加入Aspirin后CCSC中的COX-2的酶活性出現(xiàn)了降低，但是通過特異性的siRNA抑制COX-2，或者小分子抑制劑NS-398并不能誘導CCSC的凋亡，

10、也不能上調FasL的表達。另一方面，在CCSC中同時加入Aspirin和PGE2并不能降低凋亡的比率及下調FasL的表達，這些證據(jù)提示Aspirin通過非COX-2途徑上調FasL。
　　4.Aspirin通過乙?；M蛋白H3來上調FasL。
　　我們比較了非甾體抗炎藥包括（水楊酸，Aspirin，吲哚美辛，布諾芬，舒林酸）對CCSC中FasL的影響，發(fā)現(xiàn)僅Aspirin能上調FasL的表達。而比較這些非甾體抗炎藥結構，我們

11、發(fā)現(xiàn)Aspirin中具有乙?；鶊F，提示乙?；谏险{FasL中起著重要的作用。去乙?；敢种苿㏕SA處理CCSC后FasL水平明顯上調。分析組蛋白乙?；潭群蟀l(fā)現(xiàn)僅組蛋白H3乙?；潭壬撸疑叩囊阴；M蛋白H3促進了FasL的轉錄。
　　研究結論：
　　Aspirin能顯著抑制CCSC的腫瘤干細胞特性，同時通過選擇性上調FasL誘導其凋亡來抑制CCSC。 Aspirin上調FasL是非COX-2依賴的，通過乙?；M蛋白H3